Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'
- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3')
và Xan 322 (5'
-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Xan 1330 100 pmol/μl 10 pmol/μl
Xan 322 100 pmol/μl 10 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI
DNA mẫu 10 – 100 ng
H2O cất vừa đủ 25 μl
Chu kỳ nhiệt
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 940C 4 phút
Chạy chu kỳ (30 chu kỳ)
- Biến tính 940C 1 phút
- Bắt cặp 560C 45 giây
Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C
Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Sử dụng cặp primer có các thông số nhƣ sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70
C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG-<T>- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-<T>- 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 434 bp (Darrasse và ctv, 1994).
Thành phần phản ứng
Thành phần Nồng độ cuối
10X buffer PCR 1X
MgCl2 50 mM 1.5 mM
dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Erw1 75 pmol/μl 10 pmol/μl
Erw2 83 pmol/μl 10 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI
H2O cất vừa đủ 25 μl
Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo quy trình của
Seo và ctv, 2001. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 950C 5 phút
Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
- Biến tính 940C 30 giây
- Bắt cặp 650C 30 giây
- Kéo dài 720C 45 giây
Giai đoạn kết thúc 720C 10 phút
Giữ ở 40C
Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh trong quá trình làm để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
Điện di và đọc kết quả PCR
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 μl sản phẩm PCR và 2 μl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 – 50 phút với cƣờng độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V.
Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung
dịch EtBr trong khoảng 15 – 20 phút.
Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào máy
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng
Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật.
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng
xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh nhƣ sau: Trên chồi địa lan
(a) (b)
Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan.
a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
Trên giả hành
Trên phát hoa
(a) (b)
(c) (d)
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành.
a. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh.
(a) (b) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa.
a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 10 năm 2005) điều tra tháng 10 năm 2005)
Vƣờn điều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do virus Số chậu bệnh do nấm 1 200 60 100 0 2 15.000 3.000 750 3.000 3 1.000 500 100 0 4 7.000 2.800 210 0 5 2.000 1.400 400 800 6 150 0 15 8 7 150 60 15 15 8 20.000 0 0 600 9 300 0 0 0 10 2.500 0 1.750 1.000 11 1.000 800 0 200 12 400 160 80 120 13 400 80 40 100 14 450 45 405 135 15 2.000 0 1.200 200 16 3.500 2.450 350 350 17 500 150 50 50 18 1.000 100 0 100 Tổng cộng 57.550 11.605 5.465 6.678
Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra nhƣ sau: bệnh do vi khuẩn: 20,17%, bệnh do virus: 9,5%,bệnh do nấm: 11,6%.
Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vƣờn điều tra (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), có vƣờn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra. Nhƣ thế, không thể kết luận đƣợc vƣờn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh tiềm ẩn, chƣa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hƣởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý.
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vƣờn địa lan có bệnh chết cây xuất hiện và vƣờn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vƣờn về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vƣờn đều nhận biết đƣợc triệu chứng bệnh và điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhƣng đa số các hộ trồng chƣa phân biệt đƣợc bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra.
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra.
0 5 10 15 20 25 T ỉ l ệ n h iễ m b ện h ( %) Vi khuẩn Virus Nấm Tác nhân gây bệnh
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Trƣớc tình hình đó, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh do vi khuẩn gây ra và tiến hành phân lập. Kết quả là phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (Hình 4.4):
a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
Erwinia carotovora subsp. carotovora là vi khuẩn gram âm. Cho nên chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng để loại bỏ những dòng vi khuẩn gram dƣơng bằng cách sử dụng KOH 3%. Tuy nhiên, cách kiểm tra này cũng không cho kết quả thật chính xác. Có thể bị nhầm lẫn giữa gram âm và gram dƣơng đối với những vi khuẩn có thời gian nuôi lâu, nó cũng tạo nhớt khi huyền phù trong KOH.
4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 4.3.1. Trên môi trƣờng KB 4.3.1. Trên môi trƣờng KB
Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia UV. Theo Fiori và Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora
không phát sáng trên môi trƣờng KB. Do đó, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc những dòng không phát sáng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.5.1).
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA.
a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
4.3.2. Trên môi trƣờng YDC
Theo Seo và ctv (2001), khi thử nghiệm sinh lý, sinh hóa trên 87 dòng vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora thì thấy trong 22 dòng Thái Lan có 5 dòng sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC, 23 dòng Hàn Quốc và 24 dòng Nhật Bản đều không sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC. Nhƣ vậy, giữa các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora có sự đa dạng về đặc tính kiểu hình phenotyp, do chúng có phổ ký chủ và sự phân bố địa lý rộng.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trƣờng YDC để xem sự sản sinh sắc tố vàng và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. Sau 24 giờ quan sát thấy trên môi trƣờng YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu rất đặc trƣng (Hình 4.5.2).
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
a
Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
b
a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. a a b a a
Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
a. Khuẩn lạc vi khuẩn phát sáng khi chiếu dƣới tia UV, tạo thành quầng sáng xung quanh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Khuẩn lạc vi khuẩn không phát sáng khi chiếu dƣới tia UV.
b a
4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, lá địa lan
Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trƣờng YDC, chúng tôi tiến hành chủng lên củ khoai tây và lá địa lan.
4.4.1. Trên củ khoai tây: sau 48 giờ chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu
hiện nhƣ sau:
Sau 48 giờ chủng vi khuẩn, quan sát thấy 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây hại mạnh: EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 và EC06-19 với các triệu chứng nhƣ hình 4.6.1. Ngoài ra, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của vi khuẩn bị giảm.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng).
a. Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày. b. Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày. c. Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng. d. Vết bệnh hơi lõm xuống, nhày, xung quanh vết bệnh có đƣờng viền màu nâu nhạt.
4.4.2. Trên lá địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhƣ các dòng vi khuẩn
không gây bệnh trên lá địa lan. Chỉ duy nhất có dòng EC06-8 gây bệnh. Vết bệnh có màu vàng xanh, lan theo chiều rộng của phiến lá. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có viền màu nâu đen (Hình 4.6.2).
Sau đó, chúng tôi đã tiến hành phân lập lại từ lá địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu hiện bệnh. Kết quả thu nhận đƣợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (Hình 4.6.3).
4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó, chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,…Có nhiều phƣơng
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA.
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250 C).
a. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có màu nâu đen.
b. Vùng bị bệnh có màu vàng xanh.
a b
pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Tuy giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng.
Chúng tôi đã tiến hành ly trích một số dòng vi khuẩn. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra DNA. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở hình 4.6.
Qua hình trên cho thấy các mẫu ly trích có độ tinh sạch chƣa cao. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (RNA và protein) ở phía dƣới. Có thể loại bỏ đƣợc phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNAse. Có một số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài. Tuy nhiên, DNA thu đƣợc tƣơng đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Trƣớc khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong nƣớc cất vô trùng hoặc TE 1X. Do lƣợng DNA mẫu dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lƣợng DNA mẫu quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose để kiểm tra.
Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn.
1. EC06-1, 2. EC06-3, 3. EC06-5, 4. EC06-6, 5. EC06-7, 6. EC06-8, 7. EC06-9, 8. EC06-10. Điện di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 3 μl mẫu/giếng.
DNA tổng số
Phần tạp nhiễm
4.6. Phản ứng PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Chúng tôi đã tiến hành chạy PCR trên các dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC06- 6, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer Xan 1330 và Xan 322.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. Tuy nhiên thấy xuất hiện 2 band điều đó chứng tỏ có sự tạp nhiễm. Lý do của sự tạp nhiễm này có thể đƣợc giải thích có thể tạp nhiễm trong khi ly trích hoặc tạp nhiễm khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Để khắc phục hiện tƣợng này, chúng tôi đã nâng nhiệt độ bắt cặp từ 560
C lên 580C. Kết quả là thu đƣợc một band.
1 2 3 4
Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560 C).
1. EC06-1, 2. EC06-8, 3. EC06-9, 4. EC06-19. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.
Sản phẩm PCR
1 2 3 4
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580
C).
1. EC06-8. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.