3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn
Vi khuẩn đƣợc nhân sinh khối trong môi trƣờng LB lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, thu sinh khối và tiến hành ly trích.
Ly trích DNA theo phƣơng pháp sử dụng CTAB:
1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC. Rửa sinh khối vi khuẩn đƣợc với 1 ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex (rửa 2 – 3 lần). Ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4oC.
2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10%, trộn đều bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 h.
3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex.
4. Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (1/10 thể tích), pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65oC trong 10 phút.
5. Chiết xuất dung dịch DNA với 500 µl dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1). Trộn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4oC. 6. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới .
7. Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4 oC.
8. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol (2/3 thể tích dung dịch thu đƣợc), ủ ở - 20 oC/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4 oC. Lấy kết tủa sau ly tâm.
9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20 oC, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4 oC. Đổ cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
10.Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4 oC trong suốt thời gian tiến hành đề tài.