4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.4. Kết quả phản ứng PCR
4.4.1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS
Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng. Sau khi hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B.
Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA
1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC.
Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh.
4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and Gel band Purification Kit (Amersham Company).
Cf1 HM2 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR. 4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF
Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR dùng cặp mồi trên đối với các dòng vi khuẩn CC1, CC2, HM1, HM2 và Q12 – 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
-Các dòng CC1, CC2, HM2 và Q12 – 1 tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hoàn toàn phù hợp với báo cáo của Young Jin Park và ctv (2004). Do đó, có thể kết luận các dòng vi khuẩn này là Xanthomonas campestris pv. campestris.
-Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri không tạo sản phẩm khuếch đại. -Riêng dòng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc 1 kb. Tuy là kết quả dƣơng tính nhƣng chƣa thể có kết luận định danh đối với dòng vi khuẩn này.
Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF
1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC.
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1. Kết luận
Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm của Tp. HCM: Tiến hành khảo sát trên ruộng rau, thu thập các mẫu lá xuất hiện các đốm nhỏ màu nâu đen, rửa sạch đất cát, ủ ẩm trong bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc khi phân lập.
Phân lập vi khuẩn từ các đốm bệnh trên lá: Rửa sạch lá bằng nƣớc vòi, mỗi mẫu bệnh chọn các đốm bệnh còn mới màu xanh giọt dầu để phân lập. Khử trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng 5 – 10 phút. Hút dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ ở 28oC trong 24 – 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích.
Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng.
535 bp 1 kb
Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng.
Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2. Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris.
Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris.
5.2. Đề nghị
Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long, Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn (cây họ thập tự).
Hoàn thành đề tài ở mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở.
Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật RFLP.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206.
3. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virút hại cây trồng. NXB Giáo Dục Hà Nội. Trang 99 – 100.
4. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau
ngoại thành Tp Hồ Chí Minh. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ
Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.
5. Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996. Sổ tay người trồng rau . Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang.
6. Trần Thanh Tùng, 1997. Những bệnh hại quan trọng trên một số loại rau
trồng phổ biến tại Tp Hồ Chí Minh và biện pháp phòng trừ. Thông báo
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
7. Bradbury, J.F., 1986. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK: CAB International.
8. Gaetan, S., and Lopez, N., 2005. First outbreak of bacterial leaf spot
caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina. Plant Disease.
89: 683 – 684.
9. Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002. Phylogenetic analysis of Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer
sequences. Inetrnational Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 52: 355 – 361.
10.John P. Curran, 2002. Automated DNA sequencing (ABI PRISM 3100).
Training Manuals/Protocols.
11.Klement, Z., 1982. Hypersensitivity. Phytopathogenic Prokaryotes. Pages 149 – 177.
12.M. S. Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C., Madden, L.V., and Hoitink, H.A., 2003. Isolation and characterization of rhizobacteria from composts that suppress the severity of bacterial leaf spot
of radish. Phytopathology. 93: 1292 – 1300.
13.Massomo, S.M.S., Hanne Nielsen, Mabagala, R.B., Keld Mansfield – Giese, John Hockenhull, and Mortensen, C.N., 2003. Identification and
characterisation of Xanthomonas campestris pv. campestris strains from
Tanzania by pathogenicity tests, Biolog, rep – PCR and fatty acid methyl
ester analysis. European Journal of Plant Pathology. 109: 775 – 789.
14.Moffett, M.L., Trimboli, D., and Bonner, L.A., 1976. A bacterial leaf spot
disease of several Brasssica varieties, Aust. Plant Pathology. Soc. 5: 30 –
32.
15.Pernezny, K., and Dickstein, E., 2003. An outbreak of bacterial leaf spot disease of cabbage in Southrn Florida caused by Xanthomonas campestris
pv. armoraciae. Plant Disease. 87: 872 – 873.
16. Ruissen, M.A., and Gielink, A.J.,1993. The development of black rot in cabbage as a result of difference in guttation between cultivars. Proceedings
of the Eight International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, 9-12 June 1993, Versailles, France. Pages 178 – 185.
17.Shaad, N.W., 1994. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria, second edition. APS PRESS, The American Phytopathological
Society. 165 pages.
18.Steven T. Koike, Azad, H.R., and Cooksey, D.A., 2001. Xanthomonas leaf spot of cantip: a new disease caused by pathovar Xanthomonas campestris.
Plant Disease. 85: 1157 – 1159.
19. Van den Ackerveken, G.F., Marois, E., and Bonas, U. 1996. Recognition of
the bacteria avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell.
Cell. 87: 1307 – 1316.
20.Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 1993. Conservation of secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal
bacteria. Trends Microbiol. 1: 175 – 180.
21.Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998. Entry of Xanthomoas campestris pv. campestris into hydathodes of Arabidopis
thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis. Molecular Plant –
Microbe Interaction. 11: 537 – 543.
22.Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006. Identification of isolates that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv. raphani
and pathogenic and genetic coparison with related pathovars.
Phytopathology. 96: 735 – 745.
23.Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leaf crucifery in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas
campestris. Plant disease. 84: 1008 – 1014.
24.Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv.
maculicola. Plant Disease. 84: 1015 – 1020.
25.Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong Suk Park, 2004. Sensitive and specific detection of Xanthomonas
campestris pv. campestris by PCR using species specific primer based on
HrpF gene sequence. Microbiological Resarch. 159: 419 – 423.
PHỤ LỤC 1. Cách thức pha một số hóa chất cần thiết Pha Phenol
- Hòa tan 100 g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hòa tan).
- Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch bazơ 0.5M, pH8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lƣu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe.
- Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch tris HCl 0.5M, pH8.
- Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên.
- Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu đƣợc một lớp TE 1X (50 ml).
- Bảo quản phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc).
Pha dung dịch TE 1X
Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH8 Trƣớc hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8.
Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nƣớc tinh sạch. Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.
2. Thành phần môi trƣờng
Chuẩn bị môi trƣờng PDA (potato dextrose agar):
Nguyên liệu Liều lƣợng
- Khoai tây gọt sạch vỏ 500 g - Dextrose 10 g - Agar 15 g - Nƣớc cất 1 lít
Khoai tây cắt thành miếng, cho vào 1 lít nƣớc đun sôi trong 40 phút. Lọc, thêm nƣớc cho đủ 1 lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan bằng máy khấy từ, dịch môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng bằng nồi hấp ở 121oC trong 30 phút. Sau khi hấp, để nguội đến 50o C và đổ vào đĩa petri.
- Môi trƣờng YGC:
Glucose 5g Yeast extract không có agar 5 g Calcium carbonate 40 g Agar 15g Nƣớc 1 lít - Môi trƣờng LB: NaCl 10g Yeast extract 5g Peptone 10g Nƣớc 1 lít
Hòa tan lần lƣợt các chất trong nƣớc bằng máy khuấy từ. Hấp ở 121 oC trong 20 phút.
3. Pha dung dịch Alcohollic lactophenol
Hóa chất Tỉ lệ thể tích Lactic acid 1 Phenol 1 Glycerol 1 Nƣớc 1 Ethanol 8