VII Lys, A2bu Asp
Phân tích thành phần menaquinone
1. 100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 2-3 giờ.
2. Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay
3. Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút chân không 4. Thêm 50 μl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng và nhiệt độ
cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy).
5. Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone.
6. Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml acetone, trộn đều. 7. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ lỏng.
8. Thêm 50-100 μl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass spectrometer (MS) 9. Điều kiện chạy HPLC
- Dung môi: Methanol: Propanol (2:1) - Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min - Nhiệt độ cột: 40oC
- Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm
Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MS chính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồi so với giá trị trong bảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối cùng và cao nhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12.