Sự khởi đầu ra hoa ở cây xảy ra thƣờng theo sau sự cảm ứng của các tín hiệu môi trƣờng. Trong điều kiện in vivo và in vitro, giai đoạn này thƣờng đƣợc nhận biết bởi sự tích lũy và lƣu giữ tinh bột, sự phân bố lại phức tạp hơn của mạng lƣới nội chất trong toàn bộ tế bào chất, sự tăng tổng hợp DNA, tăng cƣờng hoạt động của ty thể, của các enzyme thủy giải, tăng mật độ ribosome, tăng hoạt động của các quá trình nguyên phân và hệ số hô hấp ở đỉnh sinh trƣởng hoa (Ebrahim Zadeh và Nicolas – Prat, 1969; Salisbury, 1971; Yeung và Peterson, 1972; Wardell vavf Skoog, 1973; Trần Thanh Vân và Chlyah, 1976; Bernier và ctv, 1977). [9]
Thông thƣờng các hoa tạo ra trong ống nghiệm có kích thƣớc nhỏ hơn hoặc có hình dạng khác thƣờng so với hoa ngoài tự nhiên (Buteko, 1964; Ganapathy, 1969; Mehra và Mehra, 1972; Trần Thanh Vân, 1973a; Scorza và Janick, 1980) [9]. Chẳng hạn ở cây nhân sâm, hoa tạo ra trong điều kiện in vitro có kích thƣớc nhỏ hơn so với hoa trong điều kiện tự nhiên mặc dù hoa vẫn có đầy đủ các cơ quan hoa)[23]; ở cây hoa hồng, đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc có khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong môi trƣờng thiên nhiên... [26]; ở cây Gentiana triflora Pall. var. axillarflora, tuy màu sắc hoa có sáng hơn, số bao phấn ít hơn nhƣng hoa vẫn có hình chuông nguyên thủy (Zhang và Leung, 2000). Ngoài ra, việc điều khiển ra hoa trong ống nghiệm còn một hạn chế đó là tỉ lệ nở hoa không đạt đƣợc 100% nhƣ mong đợi. [23,36]
2.5 CÁC NGHIÊN CỨU RA HOAIN VITRO
2.5.1 Trên thế giới
Chang và Hsing (1980) tạo phôi từ các mô sẹo rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) và các phôi này ra hoa khi nuôi cấy trên môi trƣờng 1/2 MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l GA3. [23]
Haeng Soon Lee, Kwang _ Wong Lee, Seung Gyun Yang và Jang Ryol Liu (1991): từ tế bào hợp tử (zygotic embryos) nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm trên cây nhân sâm (Panax ginseng). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng muối vô cơ MS (1962) có nồng độ nitrogen giảm đi một nửa, 100mg/l myo_inositol, 0,4mg/l thiamin HCl, 30mg/l sucrose và kích thích sinh trƣởng BA, GA3, ABA. Sau 10 tuần nuôi cấy, cây nhân sâm ra hoa với tỉ lệ cao nhất trên môi trƣờng chứa 5µm BA và 5µm GA3. Ngoài ra, trên các môi trƣờng chỉ chứa BA; tổ hợp BA+GA3+ABA, hoặc BA + ABA cây cũng cho ra hoa với tỉ lệ tƣơng đối cao.
G. R. Rout và P. Das (1994) nghiên cứu tạo phôi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus.Đốt thân của cây con tái sinh từ phôi soma đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose. Sau 12 tuần nuôi cấy thì cho hoa, môi trƣờng lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn môi trƣờng có agar (60-70% so với 25-30%). [36]
Rajani S. Nadgauda và ctv (1997) báo cáo rằng khi nuôi cấy cây con in vitro
của giống tre Babusa arundinacea trong môi trƣờng MS lỏng chứa 2% sucrose, 5% nƣớc dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng có 70 % mẫu cấy ra hoa. [37]
Nadgauda et al (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây Dendrocalamus
strictus. Cây đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng ½ MS có bổ sung các nồng độ khác
nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và để trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20
C. Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS không chứa TDZ. Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa cao
nhất sau 2 tuần nuôi cấy trên những mẫu cấy đƣợc cấy chuyền từ môi trƣờng ½ MS có chứa 0,5mg/l TDZ sang môi trƣờng ½ MS.
Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewa Koji và Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuôi cấy in vitro. Trên môi trƣờng ½ MS, với nitrat là nguồn nitro duy nhất, 5% sucrose, 0,1µm kinetin trong điều kiện nuôi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy đƣợc cảm ứng tạo hoa trên 100% số lƣợng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là 9 sau 8 tuần nuôi cấy. [29]
S. Sudhakaran và V.Sivasankari (2002): chồi của cây húng (Ocimum basilicum
L.) đƣợc cấy trên môi trƣờng 1/2 MS có bổ sung BAP (3- 5- 7 mg/l) và IAA (1-3-5 mg/l). Sau 20 ngày nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro ở môi trƣờng có nồng độ BAP là 7 mg/l và IAA là 5 mg/l. [35]
G. Y. Wang, M.F.Yuan và Y.Hồng (2002) đã nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm ở 6 loại hoa hồng. Cây con tái sinh từ chồi sau 45 ngày thì chuyển sang môi trƣờng MS chứa 400 mg/l myo–inositol, 30 g/l sucrose bổ sung các chất điều hoà sinh trƣởng zeatin, TDZ, NAA, BA, IAA, GA3 ở các nồng độ khác nhau. Sau 156- 561 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro với mật độ hoa cao nhất ở môi trƣờng chứa 0,5 mg/l TDZ hoặc 0,5 mg/l zeatin kết hợp với 0,1 mg/l NAA (49,2%, 44,2%). [21]
Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành công khi callus có đƣợc từ thân rễ của Cymbidium ensifolium var. misericors ra hoa in vitro trên môi trƣờng 1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng độ 10–33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy. [31]
2.5.2 Trong nƣớc
Nguyễn Hồng Vũ và ctv (2003) lần đầu tiên điều khiển thành công ra hoa trong ống nghiệm ở cây hoa hồng. Đặc biệt, tác giả đã phát hiện 2 yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định đối với sự nở hoa của thực vật là cytokinin và đƣờng, trong đó, đƣờng là yếu tố tác động chính lên sự hình thành hoa in vitro, còn cytokinin giúp làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp biệt hoá các cấu trúc hoa ở giai đoạn sau khi
tƣợng hoa, làm chất kích thích sự hình thành hoa. Tuy nhiên đề tài vẫn còn một số điểm chƣa hoàn thiện lắm: đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc có khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong môi trƣờng thiên nhiên...do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm. [26,27]
Phạm Thị Minh Thu và ctv (2005) đã cho loài hoa Torenia màu tím (Torenia Fournieri) trổ hoa thành công trong ống nghiệm từ mẫu chồi đƣợc tái sinh từ lá cây
Torenia mọc lên từ hạt. Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và ctv đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm làm thay đổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng bằng cách bổ sung yếu tố vi lƣợng vào môi trƣờng sống của cây.[12,34]
Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tấn Nhựt (2006) đã điều khiển làm cho những đóa hoa lan đầu tiên nở trong ống nghiệm ở loài lan Dendrobium Mild Yumi. [17]
Lê Hồng Thủy Tiên và ctv (2006) điều khiển ra hoa thành công cây dừa cạn (Catharanthus roseus) trong điều kiện in vitro. Theo thí nghiệm này, môi trƣờng thích hợp nhất cho sự ra hoa của cây dừa cạn trong ống nghiệm là môi trƣờng MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA.Tỉ lệ ra hoa là 100%.Cây ra nụ sau 58 ngày nuôi cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình có 4 hoa/cây. [4]
Nguyễn Thị Mỹ Duyên và ctv (2007) đã tiến hành thí nghiệm nở hoa trong ống nghiệm trên hai giống lan Dendrobium mini và Giả Hạc và đã đạt đƣợc thành công đáng kể khi hai loại hoa lan này đã lần lƣợt ra hoa trong ống nghiệm. [13]
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
3.2 NỘI DUNG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung:
Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl)
3.3BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 1 mẫu.
3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sò
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò.
Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò.
Nghiệm thức Môi trƣờng Cƣờng độ ánh sáng (lux) 1 (ĐC) MS 900 2 MS 1800 3 MS 2700 4 MS 3600
Ghi chú: 900 lux ≈ 1 bóng đèn neon
Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu:
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa
Bảng 3.2. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa
Nghiệm thức Môi trƣờng GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa
(%) 1 (ĐC) MS 0 0 2 MS 0,5 0 3 MS 1,0 0 4 MS 1,5 0 5 MS 2,0 0 6 MS 2,5 0 7 MS 3,0 0 8 MS 0 15 9 MS 0,5 15 10 MS 1,0 15 11 MS 1,5 15 12 MS 2,0 15 13 MS 2,5 15 14 MS 3,0 15 Số nghiệm thức: 14 Tổng số bình: 126 Tổng số mẫu: 126
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò.
Bảng 3.3. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò
Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) 1 (ĐC) MS 0 2 MS 1 3 MS 3 4 MS 5 Số nghiệm thức: 4 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: 36
3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản MS với sự thay đổi nồng độ của thành phần hóa chất thực hiện thí nghiệm.
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro
của cây bắt ruồi.
Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi
Nghiệm thức Môi trƣờng KH2PO4 (mg/l) 1 (ĐC) MS 170 (theo MS) 2 MS 340 (x 2) 3 MS 510 (x 3) 4 MS 680 (x 4) 5 MS 850 (x 5) Số nghiệm thức: 5
Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro
của cây bắt ruồi.
Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi.
Nghiệm thức Môi trƣờng NH4NO3 (mg/l) 1 (ĐC) MS 1650 (theo MS) 2 MS 825 (1/2) 3 MS 412,5 (1/4) 4 MS 275 (1/6) 5 MS 206,25 (1/8) Số nghiệm thức: 5 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45
3.4 CHỈ TIÊU THEO DÕI
3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trƣởng của cây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chiều cao cây (cm): tính từ gốc đến đỉnh sinh trƣởng.
- Số lá (lá/cây): đếm số lá trên cây, tính lá đã nở ra hoàn toàn và thấy rõ cuống lá.
- Số chồi hình thành: số chồi hình thành sau khi cấy
3.4.2 Theo dõi sự ra hoa
- Tỉ lệ cây ra nụ (%): là tỉ lệ giữa tổng số cây ra nụ trên tổng số mẫu cấy.
- Thời gian ra nụ (ngày): tính từ lúc cấy đến khi có 30% cây ra nụ.
- Thời gian ra hoa (ngày): tính từ lúc cấy đến khi 30% nụ nở thành hoa đầu tiên.
- Tỉ lệ hoa nở (%): là tỉ lệ giữa tổng số hoa và tổng số nụ.
3.5 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1 Môi trƣờng nuôi cấy 3.5.1 Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là môi trƣờng MS. Tùy theo mục đích thí nghiệm mà bổ sung thêm chất điều hòa sinh trƣởng GA3 (gibberellin), BA (6_Benzyladenine); nƣớc dừa; tăng hay giảm nồng độ KH2PO4, NH4NO3. Môi trƣờng sau đó đƣợc chỉnh về pH 5,8 (bằng NaOH hoặc HCl) trƣớc khi thêm agar. Sử dụng bình nuôi cấy thể tích 500ml, phân phối vào mỗi bình khoảng 80ml môi trƣờng, hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 1210C, áp suất 1,2 atm trong thời gian là 25 phút (riêng môi trƣờng có bổ sung GA3 thì đƣợc hấp thanh trùng trƣớc sau đó mới bổ sung GA3 đã đƣợc lọc vô trùng, môi trƣờng có nƣớc dừa chỉ hấp thanh trùng trong thời gian 20 phút).
3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy
Đề tài thực hiện trên cây lan sò và cây bắt ruồi in vitro đƣợc cung cấp bởi phòng nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Cây lan sò in vitro đƣợc nhân giống sau 30 ngày tạo cây con hoàn chỉnh, có từ hai đến ba chồi trên một cây. Đây chính là nguồn mẫu sử dụng cảm ứng tạo hoa in vitro. Đối với cây bắt ruồi, sau 14 ngày nhân giống sẽ tạo cây con hoàn chỉnh có 1 chồi trên một cây.
3.5.3 Điều kiện nuôi cấy
Cây lan sò in vitro đƣợc nuôi trong phòng tăng trƣởng ở nhiệt độ 240C (± 20C), ẩm độ 55 – 60%, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày với cƣờng độ ánh sáng khoảng 1000 – 2000 lux.
3.5.4 Xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0
Chƣơng 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. NỘI DUNG 1: CÂY LAN SÕ IN VITRO
Do lan sò là một loại thực vật thân bò nên đối với sự sinh trƣởng của cây chúng tôi chỉ theo dõi chỉ tiêu về sự gia tăng số lá của cây.
4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng trên sự ra hoa của cây lan sò in vitro
Lan sò là một loại cây chịu ánh sáng kém, chỉ thích hợp với ánh sáng nhẹ lúc sáng sớm và lúc cuối buổi chiều. Nếu để trong điều kiện ánh sáng quá mạnh cây sẽ kém phát triển có thể dẫn đến cháy lá. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng đối với sự sinh trƣởng sinh dƣỡng và sự ra hoa của cây lan sò in vitro.
Sự gia tăng số chồi
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi của cây lan sò in vitro
Nghiệm thức
Cƣờng độ ánh sáng
(lux)
Số chồi trên cây 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 7,67a 8,56a 2 1800 7,11a 8,33a 3 2700 7,00a 5,67b 4 3600 5,56b 3,33c CV (%) 18,5 18,56 Ghi chú:
- Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Trong điều kiện ánh sáng yếu 900 lux, cây có số chồi hình thành cao nhất 8 chồi. Khi cƣờng độ ánh sáng tăng trên 2700 lux, cây không những không hình thành chồi mới mà số chồi đang hiện diện cũng giảm đi. Điều này cho thấy cƣờng độ ánh sáng có ảnh hƣởng rất lớn đối với sự gia tăng số chồi của cây.
Sự gia tăng số lá trên cây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số lá của cây lan sò in vitro
Nghiệm thức Cƣờng độ ánh sáng (lux) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 49,56a 60,22a 2 1800 38,89b 46,89b 3 2700 34,33bc 33,33c 4 3600 28,89c 23,44d CV (%) 17,4 19,8 Ghi chú:
- Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).
Cũng nhƣ khả năng tạo chồi, ở các cƣờng độ ánh sáng càng cao, sự gia tăng số lá trên cây càng thấp. Sự gia tăng số lá nhiều nhất là ở nghiệm thức 1 (60 lá) và thấp nhất ở nghiệm thức 4 (23 lá).
Những kết quả thu đƣợc về ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đối với sự gia tăng số chồi và số lá khẳng định rằng cƣờng độ ánh sáng yếu mới là điều kiện thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây lan sò in vitro.
Tuy nhiên, sau 60 ngày nuôi cấy dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng, cây