Bảng 3.1 Các dòng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007.
STT Kí hiệu các dòng
nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu
1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ
2 FM2 Jasmine 85 Ô Môn – Cần Thơ
3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ
4 FM4 OM 2518 Ô Môn – Cần Thơ
5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang
6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang
7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang
8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang
9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh
10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh
11 FM11 OM 504 dòng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp
17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang
18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang
19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang
3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm
3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bông gòn không thấm, bút lông, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ.
Môi trường agar nước (Water agar), PDA (Potato dextrose agar), môi trường nhân sinh khối.
Nước cất.
*Cách pha môi trường nhân sinh khối
Thành phần môi trường nhân sinh khối chứa trong một lít nước gồm:
Glucose 20g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,5g Yeast extract 5g CaCl2 1 ít
Cho hỗn hợp trên vào trong becher 1 lít khuấy cho tan hết bằng máy khuấy từ. Rót vào mỗi bình tam giác 100 ml. Đậy bình bằng nút bông và giấy bạc. Rồi đem hấp ở 121oC, 1 atm trong 15 phút.
*Cách pha môi trường agar nước (WA – water agar)
Cho 20 g agar vào 1 lít nước cất đun sôi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút sau đó cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ml.
*Cách pha môi trường PDA
Môi trường PDA là môi trường giàu cacbo hydrate chứa:
Dextrose 20g
Agar 15g
Khoai tây 200g
Khoai tây bào vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ. Lọc lấy nước trong.
Cho vừa đủ lượng agar, nước và đường khuấy đều trong lúc nấu. Đem hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 15 phút.
3.3.1.2 Phƣơng pháp phân lập nấm
Nấm được phân lập từ mẫu lúa bệnh theo các bước sau: Mẫu đưa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn 70oC.
Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5 mm sau đó ủ trên môi trường agar nước để hạn chế nhiễm khuẩn.
Ủ 2 – 3 ngày lấy sợi nấm mọc trên mẫu bệnh sang môi trường WA. Ủ 2 ngày dùng dao cấy cắt miếng thạch có sợi nấm sang PDA.
Thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm Fusarium moniliforme sau 5 – 7 ngày ủ. Tiến hành tách đơn bào tử của nấm.
3.3.1.3 Phƣơng pháp cắt đơn bào tử
Sau khi phân lập được dòng nấm mong muốn thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Qui trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau:
Lấy khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA cho vào cốc nước cất đã khử trùng. Quan sát dưới kính hiển vi để xem lượng bào tử đã thích hợp chưa nếu quá nhiều bào tử ta tiến hành pha loãng tiếp đến khi nồng độ thích hợp.
Dùng pipet hút 10 µl dung dịch bào tử lên lam có trải một lớp mỏng agar rồi trang đều sau đó ủ 12 giờ ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành quan sát trên kính hiển vi tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ rồi dùng dao cấy cắt vùng thạch chứa bào tử đó, cấy vào đĩa petri chứa môi trường WA.
Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày rồi cấy sang PDA.
Đem ủ ở nhiệt độ phòng 3 – 5 ngày bào tử sẽ mọc thành khuẩn lạc có màu đặc trưng của nấm.
3.3.1.4 Phƣơng pháp nhân sinh khối
Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối (Mục 3.3.1.1).
Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường đã chuẩn bị. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc từ 150 – 200 vòng/phút ở 26 – 30oC. Nên kiểm tra trong 2 ngày đầu vì rất dễ nhiễm khuẩn.
Sau 3 – 5 ngày tiến hành thu sinh khối bằng cách lọc trên vải lọc đã hấp khử trùng. Đặt sinh khối nấm vào giấy bạc rồi cất vào tủ -70 C.
3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA của nấm 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Nitơ lỏng
Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -mecaptoethanol. Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Chloroform/isoamylalcohol (24:1). Isopropanol. Ethanol 70%. TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
Dụng cụ thí nghiệm gồm có: cối và chày để nghiền mẫu nấm, máy vortex, bồn ủ nhiệt Memmert, máy ly tâm, eppendorf, micropipette và đầu típ các loại.
3.3.2.2 Phƣơng pháp ly trích DNA
Qui trình 1: DNA của nấm được ly trích theo qui trình Lee và Taylor cải tiến (Kurt Weising và ctv., 1995). Qui trình có thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Các bước ly trích DNA như sau:
Bước 1: Mẫu nấm được nghiền trong nitơ lỏng cho đến mịn (trong lúc nghiền cho liên tục nitơ lỏng vào để mẫu nấm không bị tan). Cho mẫu nấm đã được nghiền mịn vào eppendorf.
Bước 2: Thêm 400 l lysis buffer, vortex cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ấm ở 65oC trong vòng 1 giờ.
Bước 3: Thêm vào 400 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 14000 vòng/15phút ở nhiệt độ phòng. Hút lấy phần dịch nổi ở trên vào eppendorf mới.
Bước 4: Thêm vào eppendorf mới 400 l chloroform/isoamylalcohol (24:1). Trộn đều, ly tâm 14000 vòng/10 phút/28oC. Hút lấy phần dịch nổi ở trên cho eppendorf khác.
Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm để tủa DNA. Lắc nhẹ, ủ ít nhất 30 phút ở 4oC. Ly tâm 14000vòng/15phút/ 28o
C. Bước 6: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Rửa DNA tủa nhiều lần bằng ethanol 70%.
Bước 7: Phơi DNA đến khô rồi hòa tan DNA mẫu trong dung dịch TE 1X và giữ ở 4oC hay -20oC.
Qui trình 2: Ở bước 3 chỉ thay phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/isoamylalcohol (24:1).
3.3.2.3 Định tính DNA
Định tính DNA của nấm sau khi ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% - 1% theo các bước sau:
Chuẩn bị gel agarose bằng cách: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần, đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đông, lấy lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu.
Nạp mẫu, điện di và đọc kết quả: dùng micropipette hút lấy 4 l mẫu, trộn đều với 2 l loading buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 6 l bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn. Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 20 phút. Kết thúc quá trình điện di, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium
bromide (1%) trong khoảng 15 – 20 phút, rửa sạch gel bằng nước máy và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One của máy Gel doc 2000 (Biorad).
3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích
DNA tổng số sau khi ly trích thường có nhiều tạp có thể do các nguyên nhân sau chưa loại bỏ hết protein, DNA bị gãy, tạp nhiễm RNA. Do đó trước khi tiến hành PCR, DNA tổng số nên được tinh sạch theo qui trình dưới đây:
Bước 1: Pha loãng mẫu ly trích với TE 1X hay nước cất vô trùng theo tỷ lệ 3 mẫu : 1 TE 1X (hay nước).
Bước 2: Hút 200 l hỗn hợp chloroform/isoamylalcohol (24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ.
Bước 3: Đem ly tâm hỗn hợp ở 9800 vòng ở 10oC trong thời gian 10 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác.
Bước 4: Lập lại bước 2 và 3.
Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của eppendorf. Ủ -20oC trong 30 phút.
Bước 6: Ly tâm 9800 vòng trong 20 phút. Loại bỏ dịch nổi. Bước 7: Rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%.
Bước 8: Phơi mẫu ở 37oC cho đến khô rồi cho TE 1X vào.
3.3.3 Khuếch đại vùng tef của nấm Gibberella fujikuroi bằng kỹ thuật PCR 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Trình tự 2 mồi được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại vùng tef. Mồi xuôi: 5‟-ATG GGT AAG GA(A/G) GAC AAG AC- 3‟
Mồi ngược: 5‟-GGA (G/A)GT ACC AGT (G/C)AT CAT GTT-3‟ Dụng cụ thí nghiệm:
Máy PCR.
Micropippette, đầu típ, eppendorf các loại. Lò vi sóng.
Bồn điện di .
3.3.3.2 Thực hiện phản ứng
Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ đầu Liều lƣợng phản ứng Nồng độ cuối
5X Buffer 5X 10 1X
MgCl2 25 mM 3 1.5 mM
dNTP 25 mM 0,4 0.2 mM
EF1 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l
EF2 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l
Taq polymerase 5 u/ l 0,2 1.25 u
DNA mẫu 1
Nước Vừa đủ phản ứng 50 l
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút Giai đoạn 2:
Bước 1: 95oC trong 30 giây
Bước 2: 53oC trong 45 giây 30 chu kỳ Bước 3: 72oC trong 45 giây
Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút
3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR
Thực hiện tương tự Mục 3.3.2.3.
3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ dùng trong sắc ký như sau: máy khuấy từ, cá từ, máy đo pH, máy lắc, nồi hấp, giấy lọc, phễu, máy cô quay, bình cầu, bình lắng, ống đong thể
tích 50 ml, pipet các loại, kẹp, kéo, bình ly giải, becher các loại, ống mao quản, bản mỏng, bình tam giác các loại, tủ sấy, đèn UV.
Các hóa chất: chloroform, methanol, acid acetic, acid sulfuric, ethanol, acetone, ethyl acetate, acid chlohydride 0,5N, natri bicarbonate.
Thành phần môi trường ICI:
Glucose 80g MgSO4 5g KH2PO4 1g NH4NO3 5g Nước 1 lít 3.4.2 Phƣơng pháp sản xuất GA3
Chuẩn bị môi trường 20% ICI như Mục 3.4.1. Cho 100 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml. Đem hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 15 phút. Lấy 0,1 ml dịch nấm cho vào bình chứa môi trường.
Lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong vòng 7 ngày.
3.4.3 Phƣơng pháp trích GA3
Lọc dịch nấm bằng giấy lọc để loại bỏ sinh khối. Sau đó tiến hành trích mẫu theo qui trình phân tích GA3 của phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Dịch nuôi cấy Chỉnh pH=2,5 bằng HCl 0,5N Trích 3 lần bằng ethyl acetate (50 ml) Trích 3 lần với NaHCO3 8% Sắc ký lớp mỏng Pha nước (lớp dưới)
Bỏ
3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC
Qui trình định tính GA3 được xây dựng theo phương pháp của MacMillan (1963) trong đó chúng tôi đã thay đổi hệ dung môi giải ly cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm:
Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3.
Chấm mẫu lên bản sắc ký có chất hấp thụ Silicagel
Ly giải trong hệ dung môi CHCl3:EtOAc:AcOH [60:40:5]
Phun bản bằng EtOH:H2SO4[95:5]
Sấy bản 120oC trong 5 phút
Phát hiện GA3 bằng đèn UV (365nm)
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
Bệnh lúa von do nấm gây ra, có giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme
và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (B.Tudzynski, 1999). Trong quá trình
sinh trưởng và phát triển nấm tạo ra GAs làm cho cây lúa phát triển chiều cao vì thế gây ra các triệu chứng đặc trưng của bệnh lúa von. Dựa vào triệu chứng đặc trưng này là cây mạ bị nhiễm bệnh vươn dài ra cao hơn hẳn cây lúa bình thường, có bộ lá mỏng màu xanh vàng, thối rễ và bị chết. Ở giai đoạn đẻ nhánh, cây bị bệnh ít nở bụi, gầy và cao, lá đòng có màu xanh vàng dễ nhận biết cao hơn lên hẳn phía trên tầng lá bình thường của ruộng, lóng phát triển dài ra, thường mọc nhiều rễ phụ ở đốt (rễ gió) và có thể thấy lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh đốt thân và vị trí xung quanh đốt thân. Chúng tôi đã thu thập được 20 mẫu bệnh thuộc các giống Jasmine 85, OM 2517, OM 2514, OM 4655, OM 2518, OM 4698, OM 504 dòng 2 tại các tỉnh được biểu thị ở Bảng 3.1. Trong nhiều vụ lúa vừa qua, bệnh lúa von đã phát triển nặng trên một số giống lúa như Jasmine 85, OM 2517, IR42 ở An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh (http://www.congtyhai.com). Thực tế thu mẫu cho thấy giống lúa Jasmine 85 và OM 2517 bị nhiễm bệnh lúa von nhiều hơn các giống khác (Hình 4.1a và Hình 4.1b). Cả hai ruộng lúa này đều ở Huyện Càng Long Tỉnh Trà Vinh tại thời điểm 01/05/2007 và đều bị nhiễm bệnh lúa von nhưng ở Hình 4.1a là ruộng được trồng với giống OM 4698 (nhiễm ít) còn ruộng ở Hình 4.1b thì được trồng bằng giống OM 2517 (nhiễm nhiều). Vậy để hạn chế lúa bị nhiễm bệnh nên tiến hành các biện pháp phòng trừ sau: gieo cấy các giống lúa ít mẫn cảm với bệnh; không dùng hạt giống từ những hạt bị bệnh; xử lý hạt giống bằng nước nóng 54oC hoặc thuốc hóa học trừ nấm có hiệu quả trong việc phòng trừ
bệnh lúa von (Phạm Văn Biên và ctv., 2003). Ngoài ra, theo S.H.Ou (1985) bào tử nấm
Fusarium moniliforme có thể tồn tại trong đất 4 tháng do đó nên xử lý đất sau khi thu hoạch và trồng cách vụ để hạn chế tối đa sự phát sinh của mầm bệnh.
Ghi chú: các mũi tên chỉ cây lúa nhiễm bệnh lúa von.
4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử
Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (3 mm x 3 mm) trên môi trường WA (môi trường nghèo dinh dưỡng nên loại sự tạp nhiễm trên mẫu bệnh), từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra môi trường (Hình 4.2).
Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ngày 01/05/2007. (a) giống OM 4698 bị nhiễm nấm F.moniliforme; (b) giống OM 2517 bị nhiễm nấm F.moniliforme.
(a) (b)
Mẫu bệnh
Sợi nấm mọc trên mẫu bệnh
Hình 4.4 Màu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme trên
môi trƣờng PDA sau 7 ngày cấy.
Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên mẫu bệnh sang môi trường WA, sau 2 – 3 ngày sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường PDA (môi trường để tạo dòng thuần các dòng nấm và dùng để định danh nấm dựa vào hình thái), tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme có những đặc điểm (Hình 4.3) như : màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Trần Tùng (2005).
Theo Lester W. Burgess và ctv (1994), khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme khi được nuôi cấy trên môi trường PDA có màu sắc rất đa dạng như không màu, cam nhạt (bright organe hay pale organe), xám tím (violet grey), tím đậm (dark violet) hoặc đỏ đậm (dark magenta). Trong 20 dòng nấm được phân lập thu được 18 dòng có khuẩn lạc màu cam nhạt và 2 dòng có màu đỏ đậm.
Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm F.moniliforme sau 7 ngày cấy.
Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium moniliforme tiếp tục xem bào tử dưới kính hiển vi. Kết quả nhận thấy đại bào tử (Hình 4.5) và tiểu bào tử (Hình 4.6).
Quan sát đại bào tử và tiểu bào tử của các dòng nấm được phân lập dưới kính hiển vi ở vật kính 40X chúng tôi ghi nhận được các đặc điểm giống như mô tả của