2.5.1Tổng quát về sắc ký lớp mỏng
Sắc lý lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi qua một chất hấp thu trơ (ví dụ silicagel hay oxít nhôm), chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một lớp phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
Theo Nguyễn Xuân Dũng và ctv (1985) quá trình thực hiện sắc ký gồm các bước sau:
Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng có thể là tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic có tráng một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxít nhôm). Thông thường bản có kích thước 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm. Đôi khi dùng vật kính cỡ 2,5 x 7,5 cm để phân tích nhanh.
Theo tiêu chuẩn Stahl bản có kích thước 10 x 20 cm và 20 x 20 cm. Bề dày của kính từ 2 – 4 mm. Nếu đế bản kim loại thì mỏng hơn nhiều. Dùng kính tốt nhất vì có thể rửa dễ dàng, sử dụng lại và đặc biệt có thể dùng các thuốc hiện ăn mòn mạnh hoặc tác dụng phá hủy mạnh. Nếu cần hiện sắc ký đồ ở nhiệt độ lớn hơn 150oC cần dùng để làm bằng loại thủy tinh bosilic.
Đưa mẫu lên bản sắc ký
Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch sẵn đường “mức xuất phát‟ cách đáy bản 1 cm và đường “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu trên của bản 0,5 cm. Với bản bán sẵn, dùng viết chì vót nhọn vạch nhẹ; với bản tự tráng trong phòng thí nghiệm rất dễ tróc nên vạch cẩn thận và nhẹ nhàng bằng đầu nhọn của vi quản.
Lượng chất và hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn làm cho vệt sắc ký lớn và thường kéo dài, các vệt của các chất có giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạt của thuốc thử không cho phép.
Nếu mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp còn nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu bằng loại dung môi phù hợp (ví dụ như ete, cloroform, nước) để mẫu phải tan hoàn toàn. Dung môi dùng hòa tan mẫu để chấm lên bản là loại dung môi càng dễ bay hơi; càng ít phân cực càng tốt. Nếu dung môi dùng để hòa tan mẫu được hấp thu mạnh lên lớp mỏng thì khi dung môi giải ly đi ngang qua vết chấm tại mức xuất phát, dung môi giải ly sẽ gây nên những vết bất thường dẫn đến các vết tách được sẽ bị biến dạng nghiêm trọng.
Nhúng nhẹ phần đầu nhọn vi quản vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản. Chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng, tại một điểm, ở mức xuất phát (đối với các dung dịch nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trước khi đưa lên bản hoặc có thể làm giàu trực tiếp lên bản bằng cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau).
Nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm vào bề mặt của lớp mỏng, tránh không làm thủng lỗ trên bề mặt này. Chạm vào và lấy vi quản ra thật nhanh để dung
dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi hoặc dùng máy sấy tóc để sấy nhẹ giúp dung môi bay hơi mau, không lan thành vết to.
Nếu cần chấm nhiều dung dịch khác nhau lên cùng một tấm bản, các vết cách đáy bản 1 cm; vết này cách vết kia 1 cm; các vết nên cách bờ cạnh của bản 1 – 1,5 cm (để tránh hiệu ứng bờ). Vi quản được sử dụng trở lại sau khi rửa bằng aceton.
Sau khi chấm xong nên dùng máy sấy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi mới nhúng bản vào dung dịch ly giải.
Khai triển sắc ký đồ là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng.
Trước khi đặt bản vào trong bình, bình cần được bảo hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách khi ta rót dung môi vào bình cần để một tờ giấy lọc áp sát thành bình và sát đáy bình được tẩm dung môi. Kích thước của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể. Nếu bình không được bão hòa dung môi thì khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm do dung môi đi ở bên cạnh nhanh hơn ở giữa bản.
Sau khi mẫu đã được chấm lên bản ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai có kích thước phù hợp (bản phải thẳng đứng hoặc hơi nghiêng một góc nhỏ hơn 15độso với đường thẳng đứng), dung môi trong bình phải ngập bản 0,5 cm, tối đa 0,7 cm, nghĩa là cách điểm xuất phát 0,8 – 1 cm.
Một hệ dung môi dung ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho vết chính có giá trị Rf từ 0,3 đến 0,7.
Tùy theo hướng chuyển động, cách chuyển động, thành phần dung môi có thể có các cách khai triển sắc ký đồ sau:
+ Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển lên. + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. + Khai triển hai chiều.
Hiện sắc đồ: đối với những chất được sắc ký không màu hoặc màu rất nhạt, thì sau khai triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hóa học hoặc quang học, phóng xạ đối với các đồng vị phóng xạ.
Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC
Dụng cụ chuẩn bị
TLC
Chấm mẫu
lên bảnTLC quá trình ly Chuẩn bị giải Quá trình ly giải Phát hiện vết trên đèn UV Phun thuốc thử thích hợp lên bản, rồi sấy 120o /5’ Hình 2.9 Sơ đồ các bƣớc thực hiện TLC.
2.5.2 Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng
Cần ít mẫu.
Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích.
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và lài nên khó phân biệt được đó là một mũi để chỉ sự hiện diện của một chất hay chỉ là tạp bẩn.
Sau quá trình giải ly dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hay hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải nghĩ đến vấn đề hậu sắc ký như ở HPLC.
2.5.3 Một số ứng dụng thông thƣờng của TLC
Xác định thành phần các chất trong hỗn hợp. Xác định tính đồng nhất của hai chất.
Theo dõi quá trình phản ứng.
Xác định hiệu quả của một qui trình tinh sạch của một chất.
Xác định điều kiện thích hợp cho sự phân phân tách của sắc ký cột. Theo dõi quá trình sắc ký cột.
2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “oligonucleotide” để khuếch đại một đoạn DNA đặc biệt nào đó trong một qui trình có tính chất tự động hóa. Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu khoa học cũng như trong thương mại. Trong đó kỹ thuật PCR đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với các nhà Bảo vệ Thực vật vì kỹ thuật này giúp họ định danh đúng tên loài sinh vật gây bệnh một cách chính xác mà điều này khó thực hiện được nếu dựa vào hình thái và khả năng tạo độc tố của nấm. Bên cạnh đó phản ứng PCR thì nhanh và nhạy hơn các kỹ thuật vi sinh khác. Phản ứng vẫn tiến hành tốt với một lượng mẫu rất ít và không cần đến sự có mặt của vi sinh vật. Điều đó được
Kamel A. Abd-Elsalam và ctv (2003) chứng minh khi thực hiện phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS-Fu-f và ITS-Fu-r và phản ứng này vẫn nhạy khi nồng độ DNA của F. oxysporum
trong khoảng 10 ng – 100 fg.
Ví dụ: Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen tef của các loài nấm thuộc giống Fusarium bằng cặp mồi ef1-ef2 để tạo nền tảng cho việc định danh đúng các loài thuộc giống này đặc biệt là các loài thuộc phức hệ Gibberella fujikuroi, phức hệ
F.solani, F.oxysporum và những loài tạo trichothecene loại A và B (David M. Geiser và ctv., 2004).
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến 08/2007.
3.1.2 Địa điểm thực hiện
Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng bệnh cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Nhân sinh khối nấm Fusarium moniliforme tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Ly trích DNA tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Tiến hành PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Tiến Hành Sắc Ký Lớp Mỏng tại Phòng Hóa Lý – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Bảng 3.1 Các dòng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007.
STT Kí hiệu các dòng
nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu
1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ
2 FM2 Jasmine 85 Ô Môn – Cần Thơ
3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ
4 FM4 OM 2518 Ô Môn – Cần Thơ
5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang
6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang
7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang
8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang
9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh
10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh
11 FM11 OM 504 dòng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp
17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang
18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang
19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang
3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm
3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bông gòn không thấm, bút lông, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ.
Môi trường agar nước (Water agar), PDA (Potato dextrose agar), môi trường nhân sinh khối.
Nước cất.
*Cách pha môi trường nhân sinh khối
Thành phần môi trường nhân sinh khối chứa trong một lít nước gồm:
Glucose 20g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,5g Yeast extract 5g CaCl2 1 ít
Cho hỗn hợp trên vào trong becher 1 lít khuấy cho tan hết bằng máy khuấy từ. Rót vào mỗi bình tam giác 100 ml. Đậy bình bằng nút bông và giấy bạc. Rồi đem hấp ở 121oC, 1 atm trong 15 phút.
*Cách pha môi trường agar nước (WA – water agar)
Cho 20 g agar vào 1 lít nước cất đun sôi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút sau đó cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ml.
*Cách pha môi trường PDA
Môi trường PDA là môi trường giàu cacbo hydrate chứa:
Dextrose 20g
Agar 15g
Khoai tây 200g
Khoai tây bào vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ. Lọc lấy nước trong.
Cho vừa đủ lượng agar, nước và đường khuấy đều trong lúc nấu. Đem hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 15 phút.
3.3.1.2 Phƣơng pháp phân lập nấm
Nấm được phân lập từ mẫu lúa bệnh theo các bước sau: Mẫu đưa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn 70oC.
Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5 mm sau đó ủ trên môi trường agar nước để hạn chế nhiễm khuẩn.
Ủ 2 – 3 ngày lấy sợi nấm mọc trên mẫu bệnh sang môi trường WA. Ủ 2 ngày dùng dao cấy cắt miếng thạch có sợi nấm sang PDA.
Thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm Fusarium moniliforme sau 5 – 7 ngày ủ. Tiến hành tách đơn bào tử của nấm.
3.3.1.3 Phƣơng pháp cắt đơn bào tử
Sau khi phân lập được dòng nấm mong muốn thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Qui trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau:
Lấy khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA cho vào cốc nước cất đã khử trùng. Quan sát dưới kính hiển vi để xem lượng bào tử đã thích hợp chưa nếu quá nhiều bào tử ta tiến hành pha loãng tiếp đến khi nồng độ thích hợp.
Dùng pipet hút 10 µl dung dịch bào tử lên lam có trải một lớp mỏng agar rồi trang đều sau đó ủ 12 giờ ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành quan sát trên kính hiển vi tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ rồi dùng dao cấy cắt vùng thạch chứa bào tử đó, cấy vào đĩa petri chứa môi trường WA.
Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày rồi cấy sang PDA.
Đem ủ ở nhiệt độ phòng 3 – 5 ngày bào tử sẽ mọc thành khuẩn lạc có màu đặc trưng của nấm.
3.3.1.4 Phƣơng pháp nhân sinh khối
Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối (Mục 3.3.1.1).
Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường đã chuẩn bị. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc từ 150 – 200 vòng/phút ở 26 – 30oC. Nên kiểm tra trong 2 ngày đầu vì rất dễ nhiễm khuẩn.
Sau 3 – 5 ngày tiến hành thu sinh khối bằng cách lọc trên vải lọc đã hấp khử trùng. Đặt sinh khối nấm vào giấy bạc rồi cất vào tủ -70 C.
3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA của nấm 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Nitơ lỏng
Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -mecaptoethanol. Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Chloroform/isoamylalcohol (24:1). Isopropanol. Ethanol 70%. TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
Dụng cụ thí nghiệm gồm có: cối và chày để nghiền mẫu nấm, máy vortex, bồn ủ nhiệt Memmert, máy ly tâm, eppendorf, micropipette và đầu típ các loại.
3.3.2.2 Phƣơng pháp ly trích DNA
Qui trình 1: DNA của nấm được ly trích theo qui trình Lee và Taylor cải tiến (Kurt Weising và ctv., 1995). Qui trình có thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Các bước ly trích DNA như sau:
Bước 1: Mẫu nấm được nghiền trong nitơ lỏng cho đến mịn (trong lúc nghiền cho liên tục nitơ lỏng vào để mẫu nấm không bị tan). Cho mẫu nấm đã được nghiền mịn vào eppendorf.
Bước 2: Thêm 400 l lysis buffer, vortex cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ấm ở 65oC trong vòng 1 giờ.
Bước 3: Thêm vào 400 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 14000 vòng/15phút ở nhiệt độ phòng. Hút lấy phần dịch nổi ở trên vào eppendorf mới.
Bước 4: Thêm vào eppendorf mới 400 l chloroform/isoamylalcohol (24:1). Trộn đều, ly tâm 14000 vòng/10 phút/28oC. Hút lấy phần dịch nổi ở trên cho eppendorf khác.
Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm để tủa DNA. Lắc nhẹ, ủ ít nhất 30 phút ở 4oC. Ly tâm 14000vòng/15phút/ 28o
C. Bước 6: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Rửa DNA tủa nhiều lần bằng ethanol 70%.
Bước 7: Phơi DNA đến khô rồi hòa tan DNA mẫu trong dung dịch TE 1X và giữ ở 4oC hay -20oC.