Ưu điểm
- Dễ sử dụng, hoá chất đơn giản (chỉ cần một loại thuốc thử) - Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở hàm lƣợng 1-20 g) - Ít tốn thời gian
- Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.
- Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là Amoniumsulfate.
Hoá chất và thiết bị
Hoá chất
Dung dịch Albumin chuẩn Thuốc thử Bradford
Hình 3.2: Máy ly
tâm lạnh Hình 3.3: Bể ổn nhiệt
Thiết bị
Máy đo quang phổ UV-Vis Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch Acid.
Trong dung dịch mang tính Acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nnm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với tất cả các nhóm kị nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hoá không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ.
Các bước tiến hành
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đƣợc ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lƣợng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD = ODx-ODo. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tƣơng ứng trên trục hoành.
Dựng đƣờng chuẩn Albumine
Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0,10, 20, 30, 40, 50 g/ml. Lập các ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Nồng độ dung dịch Albumine ( g/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch Albumine (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 0 tƣơng ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút, thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 1,2,3,4,5, mỗi ống cách nhau 1 phút.
Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Đồ thị đƣờng chuẩn protein đƣợc lập ở hình 3.5 (Phụ lục trang 61)
Định lƣợng protein trong mẫu thí nghiệm
Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm.
Từ đó suy ra hàm lƣợng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Mẫu đƣợc pha loãng sao cho mật độ quang đo đƣợc trong khoảng đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu trừ đi mật độ quang của ống đối chứng, chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml).