2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới
Năm 1971, Allan và cộng sự đã dùng Chitosan để kết tủa agaropectin trong agar và chiết agarose. Somchai đã báo cáo kết quả dùng Chitosan để làm giảm phần tử điện tích âm trong agaropectin và có thể nhận đƣợc agar tinh khiết hoặc agarose.
Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đƣa vào sản xuất công nghiệp Chitin.
Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của Chitin và protein trong vỏ tôm, cua, đã cho thấy việc thu hồi các chất này rất có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần Chitin thu đƣợc, đƣợc dùng sản xuất ra các dẫn xuất có nhiều ứng dụng khác nhau.
Sản lƣợng Chitin 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nƣớc sử dụng hàng đầu là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất ở qui mô 50 kg Chitin/ngày với giá bán ra là 200-300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm Chitin-Chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu cầu Chitin-Chitosan có thể lên tới 36700 tấn/năm trong thập kỷ tới.
(Nguyễn Văn Khoa, 1994)
Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nƣớc biển đã thành lập công ty liên doanh Seafresh Chitosan để khai thác khả năng cung cấp thƣơng phẩm các chất thƣơng phẩm các chất dẫn xuất của tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với Chitin và polisaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hƣớng hoạt động chính vào các thị trƣờng xuất khẩu.
Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar - giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất khoảng 150-180 triệu sản phẩm Chitin-Chitosan /năm góp phần cùng các nƣớc sản xuất chính khác nhƣ Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga. Giá cả của các loại sản phẩm Chitin-Chitosan biến động từ 30 USD đến 400 USD/kg tuỳ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm, lƣợng bán Chitin và Chitosan đạt khoảng 2 tỷ USD.
(Nguyễn Đổng, 1994)
Nhiều nƣớc nhƣ Nhật, Mỹ, Anh, Hội Chitin thuộc cộng đồng Châu Âu “ECCHIS” đã và đang nghiên cứu một cách có hệ thống và đề cập nhiều nội dung khoa học trong đó có việc ứng dụng Chitin nhƣ một chất hấp phụ trao đổi ion để tinh chế nƣớc giải khát.
Hiện nay, có khoảng 10 công ty lớn, hầu hết ở Nhật, sản xuất Chitin – chitosan trên thế giới. Công ty Protan biopolymer, một trong những công ty lớn trên thế giới sản xuất Chitin – Chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc Chitin sử dụng để xử lý nƣớc, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều ứng dụng khác trong nông nghiệp.
Ngày nay, ngƣời ta tập trung vào các dẫn xuất của Chitin và khả năng ứng dụng của những dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A. Muzzarelli (Đại Học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào Chitin và dẫn xuất của nó.
Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, nhƣng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ.
2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam
Việc nghiên cứu, sản xuất Chitin – Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục vụ đời sống là một vấn đề tƣơng đối mới ở nƣớc ta.
Năm 1978, trƣờng Đại Học Thủy Sản bắt đầu nghiên cứu chiết tách Chitin – Chitosan.
Trƣớc yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản ngày càng cấp bách, trƣớc những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về Chitin – Chitosan, cũng nhƣ tiềm năng thị trƣờng của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nƣớc ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin – Chitosan ở bƣớc cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng ở các lĩnh vức khác nhau.
Gần đây, khi Chitin – Chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có gía trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu nhƣ: trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.
HCM, Đại Học Tổng Hợp TP. HCM, Đại Học Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ,… đã tập trung vào nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng công nghệ này. Tuy nhiên, chất lƣợng sản xuất và những ứng dụng của nó chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ.
Ở phía Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí Nghiệp Thủy Đặc Sản Hà Nội sản xuất Chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và có hiệu quả bƣớc đầu.
Ở phía Nam, Trung Tâm Công Nghệ và Sinh Học Thủy Sản phối hợp với một số cơ quan khác nhƣ: Đại Học Y Dƣợc TP. HCM, Phân Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam đã và đang nghiêu cứu, sản xuất và ứng dụng Chitin – Chitosan trong các lĩnh vực: nông nghiệp, y dƣợc và mỹ phẩm.
2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin
Sơ đồ chung cho quá trình sản xuất Chitin
Nguyên liệu Khử khoáng Khử protein
Tẩy màu Chitin
Nguyên liệu dùng trong sản xuất Chitin có thể sử dụng vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,…
Nguyên liệu có thể sử dụng nguyên liệu khô hoặc tƣơi. Tuy nhiên, việc sử dụng nguyên liệu khác nhau sẽ xử lý ở chế độ khác nhau.
Chitin đã đƣợc tách chiết từ vỏ tôm từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính.
2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học
Quy tắc chung: loại bỏ tạp chất (protein, khoáng, lipid) từ vỏ tôm.
Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhược điểm:
- Tốn nhiều hóa chất - Gây ô nhiễm môi trƣờng
- Chất lƣợng sản phẩm lại không cao. Chế phẩm Chitin nhận đƣợc thƣờng có màu vàng do tác động của các hóa chất đƣợc sử dụng trong quy trình tách chiết (đều ở nồng độ cao).
Bên cạnh đó, trong phƣơng pháp này, quá trình khử protein đƣợc thực hiện bằng NaOH:
+ NaOH ảnh hƣởng đến độ nhớt của Chitosan, cụ thể hơn là NaOH cắt mạch polysaccharide của Chitin, làm giảm độ nhớt của Chitosan xảy ra trong quá trình deacetyl hoá.
+ Dịch thủy phân protein sẽ loại bỏ do lẫn kiềm đồng thời acid amin của thủy phân không còn giá trị đích thực của chúng.
Phƣơng pháp của Heckman
Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Sấy khô ở 1000C Nghiền thành bột
Ngâm trong HCl 2N trong 48 giờ (có lắc hoặc khuấy liên tục)
Ly tâm
Trung hòa bằng dung dịch NaOH ở 1000C trong 12 giờ Tách cặn
Rửa, ly tâm theo thứ tự: nƣớc, ethanol, ether Làm khô
Nghiền tinh Bột Chitin có màu kem
Phƣơng pháp của Samuer P. Meyers và Keuns. Lee
Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch và làm khô
Xay nhuyễn, sàng
Tách protein: NaOH 3,5%, 2 giờ, 650 C Lọc, rửa sạch
Tách vô cơ: HCl 1N, 30 phút, nhiệt độ phòng Lọc, rửa sạch
Tẩy màu bằng Aceton Rửa sạch, làm khô ở 600C, 6 giờ
Chitin
Phƣơng pháp của Trƣờng Đại học Thủy sản (Nha Trang)
Vỏ tôm tƣơi
Rửa sạch Phơi khô
Ngâm vỏ tôm trong HCl 5% ở nhiệt độ phòng, 48 giờ Rửa sạch
Thủy phân bằng NaOH 8% ở 1000C trong 48 giờ Rửa sạch
Tẩy màu với KMnO4 1%, H2SO4 10% trong 1 giờ Rửa sạch
Khử màu lần 2 bằng Na2S2O3 trong 15 phút Rửa sạch
Sấy khô Chitin
Phƣơng pháp của Nguyễn Thị Anh Đào và Nguyễn Thị Thu Thủy (LVTN, 1993) Phế liệu tôm Rửa sạch, tách thịt Vỏ tôm Rửa sạch, làm khô Tách protein bằng NaOH 3.5%, W:V= 1:15, 80 – 1000C 75 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng)
Rửa sạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tách vô cơ bằng HCl 1N, W:V= 1:10 ( Tôm thẻ) = 1:15 (Tôm choáng) Ở nhiệt độ phòng, 60 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng)
Rửa sạch, làm khô Chitin thô
Tẩy màu bằng Javel W:V=1:20-1:30, 10 phút hoặc H2O2 3% / NaOH 5%, W:V= 1:20-1:30,
3 giờ (Tôm thẻ), 4 giờ (Tôm choáng)
2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học
Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, sử dụng các Enzyme protease để khử protein trong nguyên liệu để thay thế cho NaOH, Enzyme này có thể có nguồn gốc từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra.
Trong các loại protease thì chimotripsin papain và protease của vi sinh vật đƣợc sử dụng hiệu quả.
* Trần Thị Luyến và cộng tác viên trƣờng Đại học Thủy Sản đã nghiên cứu thành công sử dụng Enzyme papain làm tác nhân thủy phân protein của vỏ tôm trong công nghệ sản xuất Chitin theo quy trình sau:
Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi
Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/10V, Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/5V, nhiệt độ phòng trong 5 giờ nhiệt độ phòng trong 5 giờ
Rửa sạch
Khử protein bằng papain 13%, tỉ lệ 1W/5V, pH=5 ÷ 5.5, 70-800C, 4 giờ Rửa sạch
Tẩy màu Làm khô ở 600C Chitin
Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao, đặc biệt độ deacetyl cao. Nhƣ vậy, để nâng cao chất lƣợng của Chitosan có thể sử dụng Enzyme papain thay thế cho NaOH khử vỏ tôm.
Ngoài ra, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam còn tách chiết Chitin nhờ sử dụng Enzyme bromelin từ dịch ép vỏ dứa – Enzyme với hoạt tính thủy phân protein mạnh theo quy trình sau [5]:
Vỏ dứa Vỏ + đầu tôm tƣơi
Nghiền nhỏ Phơi khô
Chiết rút Enzyme protease Sấy lại cho khô giòn ở 400C bằng nƣớc máy từ 2-3 lần
Nghiền nhỏ
Xử lý bột đầu - vỏ tôm với dịch ép vỏ dứa
đến khi toàn bộ lƣợng khoáng trong nguyên liệu bị loại bỏ hết (thử với dung dịch HCl)
Rửa sạch
Lƣợng protein còn lại đƣợc loại bỏ tiếp bằng dung dịch NaOH 1% hoặc 2% Rửa sạch
Tẩy màu với KMnO4 0.1%, C2H2O4 1% Sấy khô
Chitin
Ưu điểm của phương pháp:
- Sử dụng nguồn protease từ nƣớc ép vỏ dứa, hoàn toàn không cần đến HCl, một thành phần quan trọng hàng đầu không thể thiếu trong phƣơng pháp hóa học để loại bỏ chất khoáng.
- Tốn ít NaOH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hiệu suất thu hồi Chitin cao hơn
- Chất lƣợng chế phẩm Chitin cũng tốt hơn phƣơng pháp hóa học thông thƣờng.
Nhược điểm:
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của phòng Các chất có hoạt tính sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới.
3.2. Nguyên liệu
Nội tạng và vỏ tôm dùng trong thí nghiệm đƣợc thu về từ các công ty chế biến thủy sản trong thành phố.
Nội tạng đƣợc thu trực tiếp tại bàn xử lý của phân xƣởng chế biến các công ty trên, sau đó cho vào các túi PE, cấp đông và bảo quản ở - 200
C.
Hình 3.1: Nội tạng tôm
Vỏ tôm tƣơi rửa sạch. Một phần để ráo trên rổ thƣa trong 30 phút, đem xay nhỏ. Một phần đem phơi khô, sau đó sấy lại cho khô giòn ở 400C rồi xay nhỏ. Đây là 2 nguồn nguyên liệu vỏ tôm khô và tƣơi để thu nhận Chitin.
3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng
Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm.
Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng:
- Cân điện tử 2200g độ chính xác 10-6(g) SATORIUS – CHLB Đức - Máy đo quang phổ UV - Vis
- Máy ly tâm lạnh ROTINA - CHLB Đức
- Máy đo pH – PHM 83 Autical pH meter – Đan Mạch - Bể ổn nhiệt
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu [4]
3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford
Ưu điểm
- Dễ sử dụng, hoá chất đơn giản (chỉ cần một loại thuốc thử) - Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở hàm lƣợng 1-20 g) - Ít tốn thời gian
- Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.
- Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là Amoniumsulfate.
Hoá chất và thiết bị
Hoá chất
Dung dịch Albumin chuẩn Thuốc thử Bradford
Hình 3.2: Máy ly
tâm lạnh Hình 3.3: Bể ổn nhiệt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiết bị
Máy đo quang phổ UV-Vis Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch Acid.
Trong dung dịch mang tính Acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nnm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với tất cả các nhóm kị nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hoá không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ.
Các bước tiến hành
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đƣợc ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lƣợng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD = ODx-ODo. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tƣơng ứng trên trục hoành.
Dựng đƣờng chuẩn Albumine
Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0,10, 20, 30, 40, 50 g/ml. Lập các ống nghiệm theo bảng sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Nồng độ dung dịch Albumine ( g/ml) 0 10 20 30 40 50
Dung dịch Albumine (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 0 tƣơng ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút, thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 1,2,3,4,5, mỗi ống cách nhau 1 phút.
Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Đồ thị đƣờng chuẩn protein đƣợc lập ở hình 3.5 (Phụ lục trang 61)
Định lƣợng protein trong mẫu thí nghiệm
Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm.
Từ đó suy ra hàm lƣợng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Mẫu đƣợc pha loãng sao cho mật độ quang đo đƣợc trong khoảng đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu trừ đi mật độ quang của ống đối chứng, chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml).
3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano) Amano)
Hóa chất
HCl 0,1 M Na2CO3 0,4M
Dung dịch Trichloacetic (TCA 0,4 M) Tyrosin tinh khiết
Thuốc thử Folin
Đệm phosphat pH = 7; 0,1 M Dung dịch Casein 1%
Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt
Máy đo quang phổ UV - Vis Máy đo pH
Nguyên tắc
Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của Enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của Enzyme. Hoạt động của Enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của Enzyme. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các bước tiến hành
Xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosin
Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g/ml dung dịch HCl.
Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp.
Trộn đều, để yên dung dịch ở 470C ±0,50C trong 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50.
Đối với ống đối chứng: Dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu