L Ờ I C Ả M Ơ N
3.3.1. Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u mô h ọ c tuy ế n sinh d ụ c cá
để nghiên cứu cấu trúc mô học tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ, chúng tôi tiến hành thu mẫu tuyến sinh dục từ tháng 2/ 2009 ựến tháng 9/ 2009 và làm tiêu bản cố ựịnh tuyến sinh dục ở các tháng khác nhau, cắt ra từng lát mỏng với ựộ dày 5ộm - 7ộm.
định kỳ 1lần/ tháng thu mẫu tuyến sinh dục của cá Chày mắt ựỏ trong ựiều kiện nuôi vỗ, với số lượng mẫu thu 6 con/ lần /tháng (3 con ựực và 3 con cái). Phân tắch tổ chức mô học tuyến sinh dục thông qua việc cắt lát tế bào tuyến sinh dục và mức ựộ thành thục qua các tháng trong năm.
3.3.1.1. Nghiên cứu hình thái ngoài tuyến sinh dục
Cá Chày mắt ựỏ ựược bắt lên, ựể cá nằm ngửa, sau ựó dùng dao và kéo giải phẫu mổ bụng cá thẳng từ lỗ hậu môn lên ựến hết phần dưới miệng, sau ựó tìm tuyến sinh dục, quan sát hình thái, mằu sắc và cân, ựo kắch thước của tuyến sinh dục.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 23
Hình 3.1. Giải phẫu nghiên cứu tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ
Trước khi cố ựịnh tuyến sinh dục ta cân trọng lượng tuyến sinh dục và xác ựịnh một số chỉ tiêu sau:
- Hệ số thành thục của cá Chày mắt ựỏ theo công thức sau: Wtsd
K% = * 100 Wo
Trong ựó:
K: Hệ số thành thục
Wo: Khối lượng cá bỏ nội quan (g) Wtsd: Khối lượng tuyến sinh dục (g)
Tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 24 - Xác ựịnh sức sinh sản của cá:
+ Sức sinh sản tuyệt ựối: Toàn bộ số trứng ựếm ựược trong buồng trứng ở giai ựoạn III hoặc giai ựoạn IV. được tắnh theo công thức:
n*p N = q Trong ựó:
N: Sức sinh sản tuyệt ựối. n: Số trứng trong mẫu q.
p: Khối lượng buồng trứng (g). q: Mẫu trứng.
+ Sức sinh sản tương ựối: Số trứng trên ựơn vị khối lượng thân cá. được tắnh theo công thức:
N s =
W Trong ựó:
s: Sức sinh sản tương ựối (trứng/gam cơ thể) N: Sức sinh sản tuyệt ựối
W: Khối lượng toàn thân cá (g)
để xác ựịnh số lượng trứng ở mỗi buồng trứng, ta ựếm số lượng trứng trong 1g ở ba phần khác nhau (ựầu, giữa và cuối), sau ựó lấy giá trị trung bình nhân với trọng lượng của toàn buồng trứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 25 đo ựường kắnh 50-100 trứng của cá ựã thành thục ở giai ựoạn IV bằng trắc vi thị kắnh trên kắnh giải phẫu.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tuyến sinh dục
Xác ựịnh các giai ựoạn phát triển tuyến sinh dục cá theo phân loại của Sakun và Butskaia (1968) dựa trên lát cắt mô tế bào.
Phương pháp làm tiêu bản tuyến sinh dục ựược thực hiện dựa trên phương pháp của Sheckan và Hrapchak (1980) và quy trình làm tiêu bản mô học của Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trường - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy Sản I.
- Cố ựịnh mẫu tuyến sinh dục của cá ựực và cá cái: Trong dung dịch Bouin có công thức như sau:
+ 750 ml dung dịch acid picric bão hòa + 250 ml formalin 40%
+ 50 ml acid axetic ựậm ựặc Ngâm mẫu trong 24h sau ựó rửa - Khử nước ở mẫu cố ựịnh
Lần lượt ựưa mẫu qua cồn Etylic với các nồng ựộ khác nhau tăng dần + Cồn 70%: 1 lần từ 30-60 phút
+ Cồn 95%: 3 lần, mỗi lần 30-60phút + Cồn 100%: 3 lần, mỗi lần 30-60 phút
- Làm trong mẫu: Mẫu ựã khử nước và ựược làm bằng xilen + Xilen I: 1 lần trong 60 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 26 - Thấm Parafin: Mẫu ựã ựược làm trong chuyển vào Parafin ựun nóng ở nhiệt ựộ từ 56-580C, thời gian thấm 60 phút.
- đúc Parafin:
+ Sử dụng máy ựể ựổ Parafin ựã nóng chảy vào khuôn ựã có mẫu, sau ựó ựặt khuôn lên dàn lạnh cho Parafin ựông lại tạo ta khối Parafin chứa mẫu. Giữ mẫu ở một mặt khuôn ựể khi cắt ựược thuận tiện.
+ Cắt gọt khối Parafin chứa mẫu: Dùng dao mỏng cắt gọt bỏ những phần Parafin thừa và mặt của khối mẫu sâu vào 3-5ộm.
- Cắt lát mẫu
+ Gắn khối Parafin chứa mẫu vào máy Microtom. + Tiến hành cắt những lát mô dày.
+ đưa lát cắt vào nước ấm (40-50oC) khoảng 1-2 phút ựể lát cắt giãn, không bị nhăn.
+ Dùng slide (lam) ựể lấy lát cắt ra khỏi nước có miết qua albumin. + đặt lên máy sấy slide ở nhiệt ựộ 40-60oC trong thời gian 1-4 giờ.
- Nhuộm mẫu theo phương pháp Sheehan và Harpchar, 1980. Dùng thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin
+ Loại bỏ Parafin ở lát cắt bằng Xilen I: 5 phút, Xilen II: 5 phút + Làm no mẫu nước: Ớ Cồn 100% I: 2-3 phút Ớ Cồn 100% II: 2-3 phút Ớ Cồn 95% I: 2-3 phút Ớ Cồn 95% II: 2-3 phút Ớ Cồn 80% I: 2-3 phút Ớ Cồn 80% II: 2-3 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 27 Ớ Cồn 50%: 2-3 phút
+ Nhúng mẫu trong nước lã 3-6 lần
+ Nhuộm Hematoxylin Ờ Mayer: 4-6 phút + Rửa qua nước chảy nhẹ: 4-6 phút
+ Nhuộm Eosin: 2-3 phút + Làm mất nước: Ớ Cồn 95% I: 10 lần nhúng Ớ Cồn 95% II: 10 lần nhúng Ớ Cồn 100% I: 10 lần nhúng Ớ Cồn 100% II: 10 lần nhúng
+ Làm trong mẫu: Xilen I: 2-3 phút; Xilen II: 2-3 phút
+ Dùng lamen sạch dán lên lam mẫu bằng BomCanada ựể bảo quản và quan sát mẫu dưới kắnh hiển vi.