L Ờ I C Ả M Ơ N
2.9.2. Tình hình nghiên c ứ u trong n ướ c
Tại Việt Nam nghiên cứu các ựặc ựiểm hình thái và sinh học cá Chày mắt ựỏ của Mai đình Yên và Hoàng Mạnh Tiến (1971), các tác giả ựã ựi sâu nghiên cứu về hình thái phân loại, một số ựặc ựiểm sinh học của cá Chày mắt ựỏ như tập tắnh sinh sống, ựặc ựiểm sinh sản, sinh trưởng v.v.
Việc nghiên cứu sự phát triển tuyến sinh dục, sự phát triển phôi cá Chày mắt ựỏ cũng như cho sinh sản nhân tạo, sản xuất giống và nuôi thâm canh cá Chày mắt ựỏ tại Việt Nam ựến nay chưa có tài liệu nào công bố ựã thực hiện.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 21
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian thực hiện:
Thời gian nghiên cứu từ tháng 2/2009 Ờ 9/2009
3.1.2. địa ựiểm nghiên cứu:
Nghiên cứu ựược thực hiện tại ao nuôi thắ nghiệm của Trung tâm Tư vấn thiết kế và Chuyển giao công nghệ Thủy sản Ờ Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I Ờ đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh.
Sử dụng 2 ao nuôi thắ nghiệm:
Ao thứ nhất có diện tắch là 777m2, ao ựược chia làm 3 lô ựược ngăn bằng lưới Polyetylen, diện tắch 1 lô là 259 m2. Tổng khối lượng cá bố mẹ là 117 kg, mỗi lô có 39 kg cá bố mẹ
Ao thứ hai có diện tắch 1,659 m2, ao chia làm 3 lô, tấm ngăn bằng lưới polyetylen, diện tắch mỗi lô là 553 m2. Tổng khối lượng cá bố mẹ là 249 kg, khối lượng cá bố mẹ trong 1 lô là 83kg.
Thu mẫu hàng tháng, từ tháng 2 ựến tháng 9 năm 2009 thu mẫu tuyến sinh dục tại Trung tâm Tư vấn thiết kế và Chuyển giao công nghệ thủy sản Ờ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I - Bắc Ninh.
Nghiên cứu tổ chức học của tuyến sinh dục và theo dõi phôi cá ựược thực hiện tại Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trường - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy Sản I.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 22
3.2. đối tượng nghiên cứu
Cá Chày mắt ựỏ (Squaliobarbus curriculus Richardson, 1846)
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp nghiên cứu mô học tuyến sinh dục cá
để nghiên cứu cấu trúc mô học tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ, chúng tôi tiến hành thu mẫu tuyến sinh dục từ tháng 2/ 2009 ựến tháng 9/ 2009 và làm tiêu bản cố ựịnh tuyến sinh dục ở các tháng khác nhau, cắt ra từng lát mỏng với ựộ dày 5ộm - 7ộm.
định kỳ 1lần/ tháng thu mẫu tuyến sinh dục của cá Chày mắt ựỏ trong ựiều kiện nuôi vỗ, với số lượng mẫu thu 6 con/ lần /tháng (3 con ựực và 3 con cái). Phân tắch tổ chức mô học tuyến sinh dục thông qua việc cắt lát tế bào tuyến sinh dục và mức ựộ thành thục qua các tháng trong năm.
3.3.1.1. Nghiên cứu hình thái ngoài tuyến sinh dục
Cá Chày mắt ựỏ ựược bắt lên, ựể cá nằm ngửa, sau ựó dùng dao và kéo giải phẫu mổ bụng cá thẳng từ lỗ hậu môn lên ựến hết phần dưới miệng, sau ựó tìm tuyến sinh dục, quan sát hình thái, mằu sắc và cân, ựo kắch thước của tuyến sinh dục.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 23
Hình 3.1. Giải phẫu nghiên cứu tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ
Trước khi cố ựịnh tuyến sinh dục ta cân trọng lượng tuyến sinh dục và xác ựịnh một số chỉ tiêu sau:
- Hệ số thành thục của cá Chày mắt ựỏ theo công thức sau: Wtsd
K% = * 100 Wo
Trong ựó:
K: Hệ số thành thục
Wo: Khối lượng cá bỏ nội quan (g) Wtsd: Khối lượng tuyến sinh dục (g)
Tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 24 - Xác ựịnh sức sinh sản của cá:
+ Sức sinh sản tuyệt ựối: Toàn bộ số trứng ựếm ựược trong buồng trứng ở giai ựoạn III hoặc giai ựoạn IV. được tắnh theo công thức:
n*p N = q Trong ựó:
N: Sức sinh sản tuyệt ựối. n: Số trứng trong mẫu q.
p: Khối lượng buồng trứng (g). q: Mẫu trứng.
+ Sức sinh sản tương ựối: Số trứng trên ựơn vị khối lượng thân cá. được tắnh theo công thức:
N s =
W Trong ựó:
s: Sức sinh sản tương ựối (trứng/gam cơ thể) N: Sức sinh sản tuyệt ựối
W: Khối lượng toàn thân cá (g)
để xác ựịnh số lượng trứng ở mỗi buồng trứng, ta ựếm số lượng trứng trong 1g ở ba phần khác nhau (ựầu, giữa và cuối), sau ựó lấy giá trị trung bình nhân với trọng lượng của toàn buồng trứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 25 đo ựường kắnh 50-100 trứng của cá ựã thành thục ở giai ựoạn IV bằng trắc vi thị kắnh trên kắnh giải phẫu.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tuyến sinh dục
Xác ựịnh các giai ựoạn phát triển tuyến sinh dục cá theo phân loại của Sakun và Butskaia (1968) dựa trên lát cắt mô tế bào.
Phương pháp làm tiêu bản tuyến sinh dục ựược thực hiện dựa trên phương pháp của Sheckan và Hrapchak (1980) và quy trình làm tiêu bản mô học của Trung tâm quan trắc cảnh báo dịch bệnh và môi trường - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy Sản I.
- Cố ựịnh mẫu tuyến sinh dục của cá ựực và cá cái: Trong dung dịch Bouin có công thức như sau:
+ 750 ml dung dịch acid picric bão hòa + 250 ml formalin 40%
+ 50 ml acid axetic ựậm ựặc Ngâm mẫu trong 24h sau ựó rửa - Khử nước ở mẫu cố ựịnh
Lần lượt ựưa mẫu qua cồn Etylic với các nồng ựộ khác nhau tăng dần + Cồn 70%: 1 lần từ 30-60 phút
+ Cồn 95%: 3 lần, mỗi lần 30-60phút + Cồn 100%: 3 lần, mỗi lần 30-60 phút
- Làm trong mẫu: Mẫu ựã khử nước và ựược làm bằng xilen + Xilen I: 1 lần trong 60 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 26 - Thấm Parafin: Mẫu ựã ựược làm trong chuyển vào Parafin ựun nóng ở nhiệt ựộ từ 56-580C, thời gian thấm 60 phút.
- đúc Parafin:
+ Sử dụng máy ựể ựổ Parafin ựã nóng chảy vào khuôn ựã có mẫu, sau ựó ựặt khuôn lên dàn lạnh cho Parafin ựông lại tạo ta khối Parafin chứa mẫu. Giữ mẫu ở một mặt khuôn ựể khi cắt ựược thuận tiện.
+ Cắt gọt khối Parafin chứa mẫu: Dùng dao mỏng cắt gọt bỏ những phần Parafin thừa và mặt của khối mẫu sâu vào 3-5ộm.
- Cắt lát mẫu
+ Gắn khối Parafin chứa mẫu vào máy Microtom. + Tiến hành cắt những lát mô dày.
+ đưa lát cắt vào nước ấm (40-50oC) khoảng 1-2 phút ựể lát cắt giãn, không bị nhăn.
+ Dùng slide (lam) ựể lấy lát cắt ra khỏi nước có miết qua albumin. + đặt lên máy sấy slide ở nhiệt ựộ 40-60oC trong thời gian 1-4 giờ.
- Nhuộm mẫu theo phương pháp Sheehan và Harpchar, 1980. Dùng thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin
+ Loại bỏ Parafin ở lát cắt bằng Xilen I: 5 phút, Xilen II: 5 phút + Làm no mẫu nước: Ớ Cồn 100% I: 2-3 phút Ớ Cồn 100% II: 2-3 phút Ớ Cồn 95% I: 2-3 phút Ớ Cồn 95% II: 2-3 phút Ớ Cồn 80% I: 2-3 phút Ớ Cồn 80% II: 2-3 phút
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 27 Ớ Cồn 50%: 2-3 phút
+ Nhúng mẫu trong nước lã 3-6 lần
+ Nhuộm Hematoxylin Ờ Mayer: 4-6 phút + Rửa qua nước chảy nhẹ: 4-6 phút
+ Nhuộm Eosin: 2-3 phút + Làm mất nước: Ớ Cồn 95% I: 10 lần nhúng Ớ Cồn 95% II: 10 lần nhúng Ớ Cồn 100% I: 10 lần nhúng Ớ Cồn 100% II: 10 lần nhúng
+ Làm trong mẫu: Xilen I: 2-3 phút; Xilen II: 2-3 phút
+ Dùng lamen sạch dán lên lam mẫu bằng BomCanada ựể bảo quản và quan sát mẫu dưới kắnh hiển vi.
3.3.2. Quan sát quá trình ựẻ trứng và thụ tinh nhân tạo của cá Chày mắt ựỏ Sau khi thăm trứng cá Chày mắt ựỏ bằng cách dùng que thăm trứng ựể Sau khi thăm trứng cá Chày mắt ựỏ bằng cách dùng que thăm trứng ựể kiểm tra ựộ thành thục sinh dục của cá cái, thấy trứng ở giai ựoạn IV chiếm tỷ lệ cao (trên 90%), lúc này trứng ựạt tiêu chuẩn (trứng có màu xanh sẫm, tròn và rời nhau) thì tiến hành cho sinh sản.
Với cá ựực kiểm tra ựộ thành thục chủ yếu bằng phương pháp trực giác, sờ bụng cá thấy mềm và khi vuốt nhẹ có sẹ trắng chảy ra thì cá ựã thành thục. Sau ựó cá ựược ựưa lên bể ựẻ, tạo dòng chảy và có hệ thống sục khắ ựể ựảm bảo hàm lượng oxy 5 - 6 mg/l, nhiệt ựộ trung bình 25oC Ờ 28oC. Tiến hành 2 ựợt cho cá Chày mắt ựỏ bố mẹ:
đợt 1: Tiêm thuốc kắch dục LRH-A ( Luteotropin releasing Hormone analog) kết hợp với DOM (Domperidone). Cá ựực ựược tiêm liều lượng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 28 bằng 1/5 so với cá cái. Cá Chày cái ựược tiêm thuốc LRH-A và DOM với liều lượng: 40 ộg LRH-A và 3 mg DOM /kg cá cái.
+ Cá cái ựược tiêm chia làm 2 lần:
Lần 1: Lượng thuốc tiêm bằng 1/ 10 tổng liều Lần 2 : Số lượng thuốc còn lại
Thời gian tiêm lần 2 cách lần 1: 4 - 6 tiếng
+ Cá ựực ựược tiêm với liều lượng: 8ộg LRH-A và 0,3 mg DOM /kg cá ựực, tiêm một lần duy nhất, thời gian tiêm cùng với lần tiêm thứ 2 của cá cái.
Sau khoảng 4- 6 giờ cá bắt ựầu ựẻ. Trứng cá ựược vuốt vào bát khô, sẹ ựược lấy ngay sau ựó và vuốt trực tiếp vào bát ựựng trứng, sẹ chảy ra ựến ựâu dùng lông gà khô khuấy ựều ựến ựấy, sau ựó cho ắt nước vào khuấy ựều và ựổ vào bình vây (Weys) ựể ấp.
đợt 2: Sử dụng não thùy cá Chép ựể kắch thắch sinh sản. Với liều tiêm cho cá cái là 4 mg não thuỳ / kg cá. Cá cái tiến hành tiêm 2 lần, thời gian tiêm lần 1 cách lần 2 là 4 - 6 giờ, liều lượng tiêm lần 1 bằng 1/10 liều dùng. Liều dùng cho cá ựực bằng 1/5 liều dùng cho cá cái, thời gian tiêm cá ựực cùng thời gian tiêm lần 2 cá cái.
3.3.3. Theo dõi quá trình phát triển phôi trên kắnh hiển vi
Trứng sau khi thụ tinh ựược ựưa vào bình vây (weys) ựể ấp. Theo dõi quá trình phát triển phôi ở các giai ựoạn khác nhau theo nhiệt ựộ môi trường nước.
Các giai ựoạn phát triển của phôi bắt ựầu từ giai ựoạn trứng bắt ựầu thụ tinh cho ựến khi cá nở ựược kiểm tra dưới kắnh hiển vi liên tục. Cứ 5 phút chụp ảnh ựể ghi lại những hình ảnh ựã quan sát ựược và xác ựịnh các giai ựoạn của
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 29 phôi.
3.4. Xử lý số liệu
Số liệu thu thập trong quá trình nghiên cứu thắ nghiệm ựược xử lý theo thống kê sinh học bằng chương trình Microsoft Excel.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 30
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Hình thái ngoài tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ
Tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ bao gồm hai tuyến nằm sát thành cơ thể, dọc hai bên sống lưngở phắa trên ruột và phắa dưới bóng hơi. Phắa cuối của hai tuyến sinh dục này ựược dẫn chung vào một ống. Ống này thông ra ngoài qua lỗ sinh dục. Trên bề mặt của tuyến sinh dục có các mạch máu và dây thần kinh.
4.1.1. Hình thái ngoài tuyến sinh dục ựực của cá Chày mắt ựỏ
Tuyến sinh dục ựực (noãn sào) của cá Chày mắt ựỏ gồm hai dải hình túi, nằm trong xoang, dọc theo phắa trên của ruột và bóng hơi, dắnh với vách trên của xoang bằng một màng mỏng ựó là màng treo tinh hoàn. Lúc còn non tuyến sinh dục có dạng sợi, gồm hai dải nhỏ màu hồng, chưa có sản phẩm sinh dục, áp sát vào cột sống. Khi thành thục tuyến sinh dục có hình dải rộng phát triển hướng xuống bụng. Trên bề mặt của tuyến sinh dục ựực có các mạch máu phát triển rất rõ ràng.
Bề ngoài noãn sào ựược bọc bởi một vỏ mỏng và cấu tạo từ một hệ thống ống dẫn tinh chạy dọc theo bề mặt của noãn sào vào sâu phắa trong và ựổ dồn vào ống dẫn chung (Hình 4.1).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 31
Hình 4.1. Hình thái ngoài tuyến sinh dục đực cá Chày mắt ựỏ Như vậy, việc nghiên cứu hình thái ngoài tuyến sinh dục cá Chày mắt ựỏ cho thấy về cơ bản chúng giống với những loài cá khác ựã mô tả [4].
4.1.2. Hình thái ngoài tuyến sinh dục cái cá Chày mắt ựỏ
Qua giải phẫu nghiên cứu tuyến sinh dục cái của cá Chày mắt ựỏ, nhận thấy ở những giai ựoạn khác nhau,có những sự biến ựổi như sau:
Hình 4.2. Hình thái ngoài tuyến sinh dục cái (gự IV)
+ Ở những con cái, tuyến sinh dục ở giai ựoạn II ựã có thể quan sát thấy tuyến sinh dục có màu hồng nhạt: Bao gồm một ựôi tuyến riêng biệt nhưng dắnh vào nhau, trên bề mặt buồng trứng có những mạch máu nhỏ, ở giữa hai tuyến có một rãnh nhỏ.
+ Tuyến sinh dục ở giai ựoạn III, buồng trứng nhỏ có màu vàng sẫm trên buồng trứng thấy xuất hiện mạch máu, ựã quan sát thấy những hạt trứng nhỏ.
+ Khi thu mẫu tuyến sinh dục ở giai ựoạn IV chúng tôi nhận thấy: Khối
Buồng trứng cá Chày mắt ựỏ
Tuyến sinh dục ựực của cá Chày mắt ựỏ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 32 lượng buồng trứng ựã phát triển cực ựại (Hình 4.2). Trên bề mặt tuyến sinh dục có các hạt trứng nổi lên mà mắt thường ta có thể quan sát rất rõ. Lúc này có thể dùng ống thăm trứng ựể kiểm tra mức ựộ thành thục của trứng. Trên bề mặt tuyến có rất nhiều mạch máu. Màu sắc của buồng trứng cũng ựã thay ựổi một cách rõ rệt từ màu vàng sẫm chuyển sang màu xanh sẫm. Hai tuyến sinh dục áp sát vào nhau nên khoảng cách giữa chúng không còn nữa.
4.2. Cấu trúc mô học các giai ựoạn phát triển tuyến sinh dục
4.2.1. Cấu trúc mô học tinh sào
Khi nghiên cứu các lát cắt tinh sào của cá Chày mắt ựỏ (Hình 4.3) nhận thấy các nang tinh ở giai ựoạn thành thục ựược bao bọc bởi một màng mô liên kết. Tuy nhiên, các tinh nguyên bào không nằm rải rác trên toàn bộ thành nang mà tập trung thành vùng mầm. Vùng mầm gồm các tinh nguyên bào sơ cấp nằm theo một dải biểu mô chạy từ ựầu ống tinh ựi xuống.
Hình 4.3. Cấu trúc mô học của tinh sào cá Chày mắt ựỏ