3.1 Đối tuợng
Bệnh viêm vú ở đàn bò sữa nuôi tại huyện Gia Lâm và quận Long Biên thành phố Hà Nội
3.2 Nguyên liệu 3.2.1 Mẫu sữa
Mẫu sữa đ−ợc lấy từ các bầu sữa của bò sữa nuôi trong các hộ gia đình ở các x4 thuộc huyện Gia Lâm và quận Long Biên, Hà Nội.
3.2.2 Các loại môi tr−ờng nuôi cấy, phân lập, giám định vi khuẩn - Môi tr−ờng n−ớc thịt
- Môi tr−ờng thạch th−ờng - Môi tr−ờng thạch máu - Môi tr−ờng Macconkey - Môi tr−ờng thạch Sapman
Các loại môi tr−ờng trên đều đ−ợc chế sẵn ở phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, khoa Thú y, Tr−ờng ĐHNNI. 3.2.3 Các loại hoá chất, dụng cụ dùng trong nghiên cứu
- Thuốc nhuộm Gram
- Dung dịch n−ớc muối sinh lý - N−ớc cất
- KOH
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 36
- Huyết t−ơng thỏ. - Thuốc thử CMT
- Giấy thử kháng sinh đồ của h4ng OXOID – Anh sản xuất - Thuốc điều trị. Thuốc của công ty VEMEDIM .
3.3 Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung
3.3.1.1 Tình hình chăn nuôi bò sữa tại Gia Lâm và quận Long Biên, Hà Nội từ năm 2004 – năm 2007
3.3.1.2 Thực trạng bệnh viêm vú bò sữa: Tỷ lệ viêm, tỷ lệ các lá vú viêm, vị trí lá vú viêm.
3.3.1.3 Phân lập và giám định các loại vi khuẩn phân lập đ−ợc từ sữa bò bị viêm vú.
3.3.1.4 Xác định khả năng mẫn cảm của vi khuẩn phân lập đ−ợc với một số loại thuốc kháng sinh
3.3.1.5 Điều trị thử nghiệm viêm vú bò sữa bằng thuốc kháng sinh của công ty VEMEDIM.
3.3.2Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.3.2.1 Ph−ơng pháp điều tra cơ bản
Bằng các số liệu tổng kết của Trạm Thú y huyện Gia Lâm và quận Long Biên qua các năm. Qua đó nắm đ−ợc các chỉ tiêu đầu con, cơ cấu đàn, tình hình chăn nuôi bò sữa hiện nay.
3.3.2.2 Ph−ơng pháp lấy mẫu sữa
Chuẩn bị ống nghiệm đựng sữa, ống nghiệm phải đ−ợc đánh số, hấp sấy vô trùng. Nguyên tắc đánh số:
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 37
1. Vú phải tr−ớc 2. Vú phải sau
3.Vú trái tr−ớc 4. Vú trái sau
Bầu vú sau khi đ4 rửa sạch bằng n−ớc máy hoặc dùng khăn lau kỹ các núm vú, bầu vú, dùng bông thấm cồn 700C sát trùng núm vú. Tr−ớc khi vắt sữa bỏ máy giọt sữa đầu, sau đó lấy mẫu sữa vào ống nghiệm chú ý tránh núm vú chạm vào miệng ống nghiệm. Vắt sữa vào ống nghiệm vô trùng theo đúng số thứ tự ở trên (National Mastitis Council., 1980) [48].
Tr−ớc khi sử dụng cần làm ấm sữa bằng cách ngâm vào n−ớc ấm 370C/15phút, lắc mạnh khoảng 25 lần trong 7 giây để mẫu sữa tan, tr−ớc khi sử dụng trộn lại vài lần.
3.3.2.3 Ph−ơng pháp kiểm tra vi khuẩn trong sữa
Mẫu sữa sau khi xử lý đ−ợc tiến hành kiểm tra theo sơ đồ sau: Sơ đồ kiểm tra vi khuẩn trong sữa
CMT
California Mastitis Mẫu sữa đ4 xử lý
Phiết kính nhuộm Methylene bleu, đếm tế
bào bạch cầu
Ly tâm 2500-3000 vòng/phút trong 15 phút, lấy cặn Thạch máu
(B.A)
Chọn những khuẩn lạc khác nhau, làm tiêu bản nhuộm gram, kiểm tra hình thái
Tiến hành một số phản ứng đặc biết để nhận biết, phân lập trên các môi tr−ờng đặc biệt, kiểm tra đặc tính sinh
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 38
Sơ đồ phân lậpStreptococcus và Staphylococcus
Cặn sữa Thạch máu (B.A) Gram Catalase (-), khuẩn lạc nhỏ, trong suốt Edward medium Streptococcus (khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong, dạng S) Giám định
Kiểm tra đặc tính nuôi cấy (Thạch th−ờng, n−ớc thịt, thạch máu) Catalase (+), khuẩn lạc to, đục trắng hoặc vàng có thể có Staphylococcus medium (hoặc Sapman) Staphylococcus (Môi tr−ờng có màu vàng) Giám định
Kiểm tra đặc tính nuôi cấy (Thạch th−ờng, n−ớc thịt,
thạch máu, gelatin)
Kiểm tra đặc tính sinh hoá Kiểm tra đặc tính sinh hoá
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 39
Sơ đồ phân lập E.coli (theo Carter G.R, 1995)
Bò bình th−ờng Mẫu sữa Bò bị viêm vú
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S-màu vàng
E.M.B
Khuẩn lạc tím đen Đếm số khuẩn lạc Khuẩn lạc đỏ Macconkey
Endo
Khuẩn lạc đỏ Khuẩn lạc thuần khiết
Brillian green Khuẩn lạc vàng chanh
Giữ trên thạch máu
Tính chất sinh học
Hình thái nuôi cấy Đặc tính sinh hoá
Hình thái gram
Di dộng
Gelatin Lismusmilk Saccaroza Galactoza Glucoza Lactoza Kligler
H2S VP MR
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 40 * Ph−ơng pháp định danh một số vi khuẩn:
Sau khi nhận biết khuẩn lạc của vi khuẩn trên thạch máu và các đặc điểm hình thái của chúng, tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hoá cơ bản, sử dụng một số biện pháp để phân biệt một số loài vi khuẩn gây bệnh chính.
- Ph−ơng pháp định danh Streptococcus gây viêm vú bò sữa:
Ph−ơng pháp CAMP: Phản ứng CAMP đ−ợc Chritstie, Atkins và Munch- Peterson (1994) phát minh và sử dụng để phân biệt các Streptococcus nhóm B (các Streptococcus gây bệnh viêm vú bò thuộc nhóm B). Phản ứng dựa trên nguyên lý: Streptococcus nhóm B sản sinh một chất có thành phần giống Protein đ−ợc gọi là CAMP factor, nó có thể cộng hoạt với độc tố β Hemolysin của Staphylococcus aureus tạo ra một vòng dung huyết hoàn toàn, hình mũi tên trên vùng dung huyết không hoàn toàn (β) của Sta.aureus.
Ngày nay, phản ứng CAMP đ−ợc cải tiến bằng cách cho thêm vào môi tr−ờng làm phản ứng 0,1% Esculin và 0,01% Ferric Citrat để xác định các Streptococcus có khả năng phân giải Esculin và phản ứng đ−ợc gọi là CAMP.- Esculin test.
Tiến hành: Cấy một đ−ờng thẳng Staphylococcus aureus chủng chuẩn (dung huyết 2 vòng α, β) chia đôi đĩa thạch (0,1% Esculin và 0,01% Ferric Citrat). Sau đó cấy các Streptococcus cần phân biệt theo h−ớng vuông góc và cách đ−ờng cấy Staphylococcus aureus trên từ 2-3mm. Bồi d−ỡng ở 370C/24h. Kết quả CAMP (+): Xuất hiện vùng dung huyết hoàn toàn hình mũi tên nơi tiếp giáp giữa đ−ờng cấy Streptoccocus với vùng dung huyết β của
Staphyloccocus aureus.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 41
CAMP – Esculin test cho phép phân biệt các loại Streptococcus theo bảng sau:
Vi khuẩn CAMP Esculin Dung huyết
Strep. agalactiae + - α, β
Strep. dysgalactiae - - α
Strep - uberis (-) hoặc (+) + O, α, γ + Ph−ơng pháp định danh một số loại Staphylococcus.
Staphylococcus bao gồm các chủng gây bệnh hoặc không gây bệnh. Yếu tố quyết định khả năng gây bệnh của Staphylococcus aureus đ4 đ−ợc xác định là men Coagulase đ−ợc sinh ra trong quá trình sống. Ng−ời ta có thể dựa vào sự có mặt của men này để phân biệt các Staphylococcus gây bệnh với
Staphylococcus khác. Phản ứng dùng để phân biệt này gọi là Coagulase test. - Nguyên lý của phản ứng: Các chủng Staphylococcus aureus trong quá trình sống có khả năng tiết ra một loại men Coagulase phân giải Fibrinogen thành Fibrin làm đông huyết t−ơng của một số động vật.
- Phản ứng Coagulase trên phiến kính: Chuẩn bị đĩa cấy vi khuẩn cần phân biệt, n−ớc sinh lý trên một lam kính vô trùng, que cấy, đèn cồn.
- Tiến hành: Lấy một khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn cần phân biệt, trộn với một giọt n−ớc sinh lý trên một lam kính sạch vô trùng, dùng que cấy lấy một vùng huyết t−ơng thỏ Citrat hoá trộn đều với hỗn hợp trên. Nếu phản ứng d−ơng tính thì hiện t−ợng đông vón sẽ xuất hiện sau vài giây.
3.3.2.4 Ph−ơng pháp kiểm tra viêm vú phi lâm sàng bằng thuốc thử CMT (California Mastitis Test)
Phản ứng đ−ợc tiến hành trên phiến kính. Dùng pipet vô trùng hút mẫu sữa đ4 xử lý, nhỏ 1-2 giọt lên phiến kính sạch, sau đó thêm vào một l−ợng t−ơng đ−ơng thuốc thử CMT, dùng đũa thuỷ tinh sạch trộn kỹ. Đặt phiến kính trên nền sẫm để đọc phản ứng. Phản ứng đọc sau vài giây.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 42
Cách đánh giá:
Cách đánh giá Kết quả CMT Số l−ợng tế bào/ml sữa
Âm tính Hỗn hợp không có biến đổi gì 0 - 200.000
(0 - 25% Neutrofil) Nghi ngờ Hỗn hợp có vẩn nhỏ li ti để một lúc thì tan ra 150.000 - 500.000 (30 - 40% Neutrofil) (+) Hỗn hợp có vẩn đục nh−ng không nhớt 400.000 - 1.500.000 (40 - 60% Neutrofil) (++) Nhanh chóng hình thành một cục nhớt dính từ vùng trung tâm hỗn hợp 800.000 - 5.000.000 (60 - 70% Neutrofil)
(+++) Hỗn hợp kết dính t−ơng đối chắc, khi nghiêng
phiến kính không bị rớt xuống
≥ 5.000.000 (70 - 80% Neutrofil) (70 - 80% Neutrofil) (++++) Hỗn hợp kết dính thành khối chắc, lật úp phiến kính hỗn hợp có rớt xuống ≥ 5.000.000 (70 - 80% Neutrofil)
3.3.2.5 Ph−ơng pháp làm kháng sinh đồ theo Kirby - Bauer
Chúng tôi áp dụng ph−ơng pháp thử mẫn cảm của vi khuẩn với các chất kháng khuẩn đăng trên cuốn “Clinical Veterinary Microbiology” của P.J.Quinn và cộng sự, tái bản 2004 [51].
Nguyên liệu:
Giống vi khuẩn đ4 phân lập, cấy thuần khiết ở các môi tr−ờng thích hợp. Cấy chuyển sang môi tr−ờng n−ớc thịt, nuôi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ. Môi tr−ờng thạch th−ờng.
Giấy tẩm kháng sinh của h4ng Oxoid của Anh cung cấp. Tiến hành:
Đĩa thạch tr−ớc khi sử dụng để tủ ấm 370C trong 20 – 30 phút để làm khô bề mặt thạch và tạo nhiệt độ thích hợp.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 43
Hút 0,2ml canh khuẩn cho vào đĩa thạch, láng đều cho canh khuẩn phủ kín bề mặt thạch, hút hết canh khuẩn thừa. Để tủ ấm 15 phút cho khô mặt thạch.
Lấy đĩa thạch ra đặt các khoanh giấy đ4 tẩm kháng sinh lên mặt thạch sao cho các khoanh giấy cách đều nhau và tiếp xúc trực tiếp với mặt thạch.
Để tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó lấy ra đọc kết quả. Dùng th−ớc đo mm để đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn.
Chúng tôi dựa vào bảng trích dẫn sau để đánh giá kết quả:
Đ−ờng kính vòng vô khuẩn (mm) Loại kháng sinh Ký hiệu Hàm l−ợng (kg) Kháng thuốc Mẫn cảm Mẫn cảm cao Penicillin PC 10 ≤ 28 ≥ 29 Tetracycline TC 30 ≤ 14 15 – 18 ≥ 19 Ampicillin AP 30 ≤ 12 13 – 14 ≥ 15 Gentamicin GM 10 ≤ 12 13 – 14 ≥ 15 Kanamycin KM 30 ≤ 13 14 – 17 ≥ 18 Cephalothin CF 30 ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 Marbrofloxacin MA 20 ≤ 19 18 - 19 ≥ 20 Ciprofloxacin CIP 5 ≤ 15 16 - 20 ≥ 21
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 44 4. KếT QUả Và THảO LUậN
4.1 Cơ cấu và số l−ợng đàn bò sữa của địa ph−ơng nghiên cứu từ năm 2004 - 6/2007
Để nắm đ−ợc tình hình chăn nuôi bò sữa tại huyện Gia Lâm và quận Long Biên trong các năm 2004 – 6/2007, chúng tôi tiến hành tổng hợp số liệu từ phòng nông nghiệp. Trạm thú y của huyện Gia Lâm và quận Long Biên, đồng thời kết hợp với điều tra cơ bản ở các nông hộ chăn nuôi bò sữa năm 2005.
Từ tháng 1/2004, huyện Gia Lâm chính thức tách thành huyện Gia Lâm và quận Long Biên. Cơ cấu và số l−ợng đàn bò sữa của 2 địa ph−ơng đ−ợc trình bày trong bảng 4.1.
Từ số liệu trong bảng 4.1 cho thấy số l−ợng bò sữa đ−ợc nuôi tại hai địa ph−ơng nghiên cứu có sự tăng lên rõ rệt qua các năm. Giai đoạn 2004 – 2005 mới có 1720 con, trong đó có 1169 con đang khai thác (67,76%); đến giai đoạn 2005 – 2006 số l−ợng bò sữa đ−ợc nuôi 2112 con (1414 con đang khai thác, 66,95%). Đến giai đoạn 2006 – 6/2007 tuy số l−ợng bò sữa không tăng nhanh nh− những năm tr−ớc, nh−ng tổng số bò sữa đ−ợc nuôi trong giai đoạn này là 2269 con, trong đó 1550 con đang khai thác (68,31%).
Tuy nhiên, phân tích cụ thể về tình hình chăn nuôi ở hai địa ph−ơng, chúng tôi cũng nhận thấy số l−ợng bò sữa của huyện Gia Lâm và quận Long Biên có sự chênh lệch lớn. Năm 2004, huyện Gia Lâm có 1520 con bò sữa cho 2300 tấn sữa. Cũng năm này, quận Long Biên chỉ có 200 con bò sữa, cho 300 tấn sữa. Đến năm 2005, tổng số bò sữa của huyện Gia Lâm là 1802 con, cho 2500 tấn sữa. Tổng số bò sữa của Quận Long Biên là 310 con, cho 450 tấn sữa.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học nụng nghiệp ------ 45
Giai đoạn từ 2006 – 6/2007 huyện Gia Lâm có tổng số bò sữa là 1854 con, cho 2700 tấn sữa. Quận Long Biên chỉ có 415 con, cho 750 tấn sữa.
Nguyên nhân dẫn đến sự chênh lệch về tổng số bò sữa nuôi tại 2 địa ph−ơng này là do có sự chuyển dịch ngành nghề cho phù hợp với từng địa ph−ơng. Quận Long Biên đi theo h−ớng dịch vụ và công nghiệp hóa, còn huyện Gia Lâm phát triển theo h−ớng hiện đại hóa nông nghiệp nông thôn, hơn nữa do diện tích rộng phù hợp với chăn nuôi nên số l−ợng gia súc ở đây phát triển mạnh.
Mặt khác, số x4 chăn nuôi bò sữa phát triển mạnh thuộc huyện Gia Lâm cũ, sau khi tách huyện lại thuộc huyện Gia Lâm mới nhiều hơn ở quận Long Biên. Huyện Gia Lâm mới có các x4 nuôi nhiều nh−: Phù Đổng, Trung Màu, D−ơng Hà, Đặng Xá. Chỉ tính riêng x4 Phù Đổng năm 2005 có 1050 con bò sữa, trung bình mỗi nông hộ nuôi từ 2 – 3 con (số liệu điều tra ở x* Phù Đổng). Trong khi đó ở quận Long Biên chỉ có ph−ờng Phúc Lợi, Giang Biên là chăn nuôi bò sữa phát triển mạnh nhất.
Nh− vậy sau khi tách huyện, tổng số bò sữa và sản l−ợng sữa tăng mạnh. Nguyên nhân thúc đẩy chăn nuôi bò sữa phát triển là do sau khi tách huyện nhờ có các chính sách phát triển kinh tế phù hợp với điều kiện của từng địa ph−ơng, đồng thời nhu cầu thị tr−ờng về sản phẩm sữa không ngừng tăng, giá sữa t−ơng đối ổn định (3500 - 4000 đồng/ kg sữa t−ơi), t−ơng xứng với công lao động mà ng−ời chăn nuôi bỏ ra. Bên cạnh đó, những hiểu biết về chăn nuôi bò sữa của ng−ời dân không ngừng đ−ợc nâng cao đ4 hạn chế đ−ợc bệnh tật, hạn chế đ−ợc số l−ợng bò sữa loại thải. Do vậy chăn nuôi bò sữa ngày càng phát triển mạnh
Tr r ư ờ n g ð ạ i h ọ c N ụ