3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi trên lợn siêu nạc các lứa tuổi khác nhau 3.1.2. Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở các trang trại chăn nuôi lợn siêu nạc theo ph−ơng thức chuồng hở, chuồng bán kín, kín hoàn toàn.
3.1.3. Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học lợn siêu nạc mắc bệnh phổi. 3.1.4. Tổng hợp các triệu chứng chính của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi. 3.1.5. Mổ khám, kiểm tra bệnh tích lợn ốm, chết, do bệnh phổi.
3.1.6. Nghiên cứu bệnh tích đại thể, vi thể của: ruột, gan, phổi, thận và hạch, lợn mắc bệnh phổi.
3.2. Nguyên liệu, địa điểm và đối t−ợng nghiên cứu
3.2.1. Nguyên liệu
* Dung dịch hóa chất
- Dung dịch n−ớc muối sinh lý (NaCl 0,9%), dung dịch Natri bicacbonnat, dung dịch cồn - axit (HCl 1%)
- Hoá chất dùng để cố định bệnh phẩm (Formol 10%)
- Hoá chất dùng trong quá trình làm tiêu bản gồm: cồn Ethylic 700, 900, 1000, Xylen, Parafin, Hematoxylin, Eosin.
* Mẫu nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi đ−ợc tiến hành trên lợn các lứa tuổi. - Mẫu máu nghiên cứu trên lợn khoẻ và lợn mắc bệnh phổi ở 10 tuần tuổi. - Các mẫu máu, gan, ruột non, hạch màng treo ruột, phổi, thận lấy từ những lợn con chết do bệnh phổi ở 10 tuần tuổi.
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực tập từ 1/1/2007 đến 01/05/2007 tại 4 trang trại chăn nuôi lợn siêu nạc:
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 31
Nguyễn Hữu Cơ: Tiên Lữ - H−ng Yên Nguyễn Văn Đẩu: Từ Sơn - Bắc Ninh Nguyễn Văn Sơn: Ninh Giang – Hải D−ơng Đặng Thu Thủy : Ch−ơng Mỹ – Hà Tây
3.2.3. Đối t−ợng nghiên cứu
Lợn siêu nạc các lứa tuổi, gồm các giống lợn: Landrace (CP109), Yorshire (CP 209), Durroc (CP809), Pietrain (CP 609)
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Chuẩn bị
- Chọn những đàn lợn có cùng thời gian đẻ, cùng có chế độ ăn uống và cách quản lý, chăm sóc nh− nhau để tiến hành theo dõi.
- Ghi sổ nhật ký hàng ngày, lập bảng theo dõi.
3.3.2. Ph−ơng pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
- Tiến hành theo dõi th−ờng xuyên, quan sát từng ô chuồng, kiểm tra từng cá thể để xem lợn mắc bệnh phổi hay có các bệnh khác không.
- Dựa vào các đặc điểm sau để nhận biết đ−ợc lợn mắc bệnh phổi: Con vật ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, da xanh, khịt mũi thở khò khè, khó thở, hắt hơi, ho khan....
Sau khi đ1 theo dõi chúng tôi ghi chép vào nhật ký và ghi rõ số tai, số nái, nhóm tuổi, ô chuồng ngày tháng bị bệnh. Từ đó ta dự đoán ra các nguyên nhân bị bệnh và một số vấn đề cần l−u ý khi ta kết thúc thí nghiệm.
Số lợn con mắc bệnh phổi
Tỷ lệ mắc bệnh phổi = x 100 Số con theo dõi
3.3.3. Ph−ơng pháp đếm số l−ợng hồng cầu
Đếm bằng buồng đếm Newbauer trên kính hiển vi quang học. Đếm ở 5 ô trung bình ở khu vực trung tâm của buồng đếm: 1 ô ở giữa và 4 ô ở 4 góc. Trong mỗi ô trung bình đếm số l−ợng hồng cầu ở 16 ô con theo nguyên tắc: trên - phải hoặc d−ới - trái để tránh hiện t−ợng một hồng cầu đ−ợc đếm hai lần. Tính số l−ợng hồng cầu trong 1 mm3máu (đơn vị: triệu / mm3)
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 32 3.3.4. Ph−ơng pháp xác định bạch cầu(%): theo công thức Schilling, đơn vị tính %
- Nguyên tắc: những bạch cầu trong máu không giống nhau, chúng khác nhau về hình thái, kích th−ớc nhân, màu sắc của các hạt và nguyên sinh chất.
- Tiến hành: dùng một lam kính sạch và trong, lau khô lam kính, sau đó nhỏ một giọt máu (bằng hạt đậu t−ơng) lên lam kính thứ hai có cạnh phẳng để tiếp súc với lam kính có máu với góc nghiêng 450, lùi lam kính thứ hai đến giọt máu để dàn đều theo cạnh lam kính rồi đẩy nhanh lam kính thứ hai tr−ợt trên mặt lam kính thứ nhất ta sẽ đ−ợc một lam kính mỏng và dàn đều. Để khô lam kính máu sau đó đ−a cố định bằng cồn Metylic trong 5 giây rồi nhuộm Giemsa và đ−a lam kính soi trên kính hiển vi với vật kính đầu.
- Tiến hành phân loại theo Schilling: đếm bạch cầu liên tiếp nhau ở 4 góc và hai đầu của tiêu bản màu theo hình chữ chi, ghi riêng từng loại bạch cầu.
3.3.5. Ph−ơng pháp định l−ợng hemoglobin
Trong môi tr−ờng axit Chlohydric (HCL), Hemoglobin chuyển thành Chlohydrat hematin có màu nâu sẫm. Dùng ph−ơng pháp so màu bằng huyết sắc kế Shali, dựa vào ống màu chuẩn để đọc kết quả.
Đơn vị tính là g%: số gam Hemoglobin có trong 100 ml máu.
3.3.6. Ph−ơng pháp tính tỷ khối huyết cầu - Hematocrit
Ph−ơng pháp của Wintrobe, dùng máy ly tâm huyết học TH - 12
- Dụng cụ: ống Hematocrit, giá để ống, th−ớc đo, bông, sáp máy li tâm. - Thao tác: máu tĩnh mạch đ1 có chất chống đông, hút máu vào ống rồi cho vào máy li tâm huyết học TH - 12 với vận tốc 3000 vòng/ phút trong 15 phút -20 phút. Chú ý khi đặt ống phải đặt đối xứng, l−ợng máu hút vào phải đều nhau, khi ly tâm xong phải lấy ống Hematocrit, dùng bông lau sạch ở ngoài. Sau đó gắn vào một đầu của ống Hematocrit mang ra đo trên th−ớc. Kết quả đo đ−ợc tính là tỷ khối huyết cầu, đơn vị là %.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 33
Công thức tính một số chỉ tiêu huyết học
Thể tích trung bình của hồng cầu đ−ợc tính theo công thức sau: Tỷ khối hồng cầu(%) x 10
VTB = Đơn vị: àm3
Số l−ợng hồng cầu(Triệu/mm3)
L−ợng Hemoglobin bình quân (LHbBQ): biểu thị l−ợng huyết sắc tố trong mỗi hồng cầu, đơn vị tính là: ààg (pg) 1ààg = 10-12 kg
Công thức tính là:
Hb (g%) . 10 LHbBQ =
Số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3)
Nồng độ huyết sắc tố trung bình (NĐHbBQ): biểu thị tỷ lệ % huyết sắc tố chứa trong 100 ml hồng cầu, đơn vị tính là % . Công thức tính là:
Hb (g%) . 100 NĐHbBQ == --- Tỷ khối hồng cầu (%)
3.3.7. Ph−ơng pháp xác định các chỉ tiêu sinh hoá máu
- Định l−ợng bilirubin huyết thanh theo ph−ơng pháp so màu của Jendrassik đo bằng máy phân tích tự động Hitachi 704.
- Định l−ợng đ−ờng huyết theo ph−ơng pháp Enzym gluco - oxydaza với thuốc màu Trinder.
- Protein tổng số định l−ợng bằng phản ứng biuret và đo bằng quang kế ở b−ớc sóng 525 nm. Các tiểu phần protein huyết thanh xác định theo kỹ thuật điện di trên phiến xeluloza axetat và đọc kết quả trên densitomester junior-24
Nguyên lý:
D−ới tác dụng của dòng điện một chiều, trong dung dịch đệm pH = 8,6 các thành phần của protêin huyết thanh đ−ợc tách ra ở các vị trí khác nhau trên phiến axetat xelluloz. Sau khi cố định, nhuộm - tẩy màu, khử n−ớc và làm trong phiến axetat xelluloz, ng−ời ta đo - tính kết qủa trên Densitometer, b−ớc sóng 525nm.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 34
Hoá chất dùng trong điện di: - Đệm Tris-barbital pH=8,6
- Thuốc nhuộm Ponceaus No 5526. - Dung dịch tẩy rửa: axit axetic 5%. - Chất khử n−ớc: metanol nguyên chất. - Dung dịch làm trong.
Kỹ thuật điện di:
Gồm các b−ớc sau đây:
- Điện di huyết thanh trên phiến axetat xelluloz trong buồng điện di ở điện thế 180 Volt trong 14 phút.
- Sau khi kết thúc điện di, ngâm phiến axetat xelluloz trong dung dịch nhuộm Ponceaus trong 6 phút.
- Tẩy thuốc nhuộm thừa: ngâm phiến axetat xelluloz trong dung dịch axit acetic 5%: 2 phút/lần, 3lần tẩy cho đến khi phiến hoàn toàn trắng. - Khử n−ớc: ngâm phiến axetat xelluloz trong metanol nguyên chất 2 lần x 2 phút/lần.
- Sau đó ngâm phiến axetat xelluloz trong dung dịch làm trong: 10 phút. - Làm khô: sấy khô phiến ở nhiệt độ 600C trong 10 phút. Kết quả đ−ợc đo - tính trên Densitometer, b−ớc sóng 525nm.
3.3.8. Ph−ơng pháp giải phẫu bệnh học
* Ph−ơng pháp mổ khám toàn diện
Quan sát từ ngoài vào trong, kiểm tra từng cơ quan riêng biệt, ghi lại những biến đổi từ bên ngoài vào bên trong vào biên bản mổ khám.
+ Kiểm tra các dấu hiệu ngoài da, xoang ngực, xoang bụng, ghi lại kết quả vào biên bản mổ khám.
* Ph−ơng pháp lấy bệnh phẩm
Dùng kéo cắt lấy một số bộ phận mang bệnh tích đặc tr−ng ở cơ quan lợn bệnh nh− mẫu phổi, gan, ruột... (khoảng 3 cm) rồi cho vào lọ chứa formol 10%.
* Ph−ơng pháp làm tiêu bản tổ chức
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 35
bệnh phẩm ra, cắt thành từng miếng đánh số thứ tự để tránh nhầm lẫn, rồi đem rửa n−ớc từ 12 - 24 giờ (d−ới dòng n−ớc nhẹ) để trôi hết formol.
- Rút n−ớc: bệnh phẩm rửa xong, lấy giấy lọc thấm nhẹ sau đó cho vào hệ thống cồn ethylic với thời gian:
Cốc 1: cồn 700 từ 2 - 4 giờ Cốc 3: cồn 1000 từ 4- 6 giờ Cốc 2: cồn 1000 từ 4 - 6 giờ Cốc 4: cồn 1000 từ 4 - 6 giờ Thời gian có thể thay đổi tuỳ theo miếng tổ chức to hay nhỏ.
- Làm xong: ta lấy miếng tổ chức ra khỏi cồn, thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống cốc đựng xylen.
Cốc xylen 1: 2 – 4 giờ Cốc xylen 2: 2 – 4 giờ Cốc xylen 3: 2 – 4 giờ
Thời gian cũng tuỳ theo miếng tổ chức to nhỏ có thể thay đổi. Sau khi cho đi qua lần l−ợt 3 cốc xylen, miếng tổ chức trong nh− đ−ờng phèn là đ−ợc.
Tẩm parafin: hệ thống tẩm parafin gồm:
Cốc 1: Parafin + xylen theo tỷ lệ 1:1 từ 2 – 12 giờ Cốc 2: Parafin từ 4 – 6 giờ ở 560C
Cốc 3: Parafin từ 4 – 6 giờ ở 560C Cốc 4: Parafin từ 4 – 6 giờ ở 560C
- Đúc Block: chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, khuôn giấy parafin dùng để đổ Block cần đ−ợc lọc kỹ tr−ớc khi đúc, khi đổ parafin phải nóng chảy hoàn toàn nh−ng nhiệt độ không quá cao sẽ ảnh h−ởng đến chất l−ợng tiêu bản.
- Cắt và dán mảnh: cắt miếng tổ chức trên máy Microtocom với độ dày 3 - 4àm. Sau đó đem dán lên lam kính, dùng kim t1i tổ chức cho phẳng (phiến kính để dán tổ chức phải sạch, không bị x−ớc, không mốc).
- Nhuộm tiêu bản:
Dùng thuốc nhuộm Hematoxylin để nhuộm nhân tế bào.
Thuốc nhuộm Eosin dùng để nhuộm nguyên sinh chất của tế bào. * Các b−ớc nhuộm tiêu bản.
+ Tẩy parafin: cho tiêu bản lần l−ợt qua 3 lọ xylen mỗi lọ để khoảng 3 - 5 phút.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 36
Khi cho tiêu bản qua lọ xylen phải chú ý nhắc lên, nhắc xuống cho tan hết parafin, dùng vải màn sạch lau sạch parafin xung quanh miếng tổ chức.
+ Tẩy xylen: dùng cồn Ethylic cho tiêu bản qua 3 cốc đựng cồn Ethylic: Cốc 1: cồn 960 từ 3 – 5 phút
Cốc 2: cồn 1000 từ 3 – 5 phút Cốc 3: cồn 1000 từ 3 – 5 phút
+ Nhuộm Hematoxylin: khi tiêu bản đi qua 3 cốc cồn tuyệt đối, ngâm tiêu bản trong dung dịch Hematoxylin khoảng 10 phút. Nếu tiêu bản bắt màu nhạt có thể nhúng nhanh tiêu bản qua NaCO3 1%. Nếu tiêu bản đậm quá có thể nhúng nhanh qua cồn - HCl 1%.
Sau khi điều chỉnh màu, rửa sạch tiêu bản bằng n−ớc cất.
+ Nhuộm Eosin: cho tiêu bản đ1 nhuộm Hematoxylin vào dung dịch. Eosin khoảng 3 - 5 phút, tuỳ theo chất l−ợng thuốc nhuộm và độ dày cơ bản. Có thể điều chỉnh màu bằng 1 - 2 giọt axit axetic. Rửa tiêu bản bằng n−ớc cất 1 - 2 phút.
+ Tẩy n−ớc: ngâm tiêu bản vào cồn 900 từ 2 - 3 phút.
+ Làm trong: khi đ1 hút n−ớc, cho tiêu bản đi qua 2 lọ xylen từ 1 - 2 phút. + Gắn lamen: quan sát tiêu bản d−ới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 10 x 15 và 20 x 15 đọc và ghi lại kết quả, chụp ảnh tiêu bản dán nh1n lên tiêu bản.
3.3.9. Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ đ−ợc xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau.
- Số trung bình: X = n xi ∑ - Độ lệch chuẩn: Sx = 1 ) ( − − ∑ n x xi
- Sai số của số trung bình: mx =
1− − ± n S n≤30; mx = 1 − ± n S n≥30
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học ------ 37