3. nội dung nguyên liệu ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1.3. Phân lập virus viêm gan vịt và định typ của chủng virus phân lập đ−ợc
3.1.4. Khảo sát một số đặc tính sinh học của virus c−ờng độc phân lập đ−ợc
- Xác định chỉ số EID50 (50% Embryo Infective Dose) của chủng virus c−ờng độc viêm gan vịt.
- Xác định chỉ số ELD50 (50% Embryo Lethal Dose) của chủng virus c−ờng độc viêm gan vịt.
- Xác định chỉ số LD50 (50% Lethal Dose ) của chủng virus c−ờng độc viêm gan vịt.
3.1.5. B−ớc đầu nghiên cứu miễn dịch thụ động với bệnh viêm gan vịt ở đàn vịt con đàn vịt con
3.2. nguyên liệu
* Giống virus
- Virus vacxin nh−ợc độc viêm gan vịt DH - EG - 2000 do bộ môn vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, khoa Chăn nuôi Thú y, tr−ờng Đại học Nông nghiệp I cung cấp.
- Virus c−ờng độc viêm gan vịt phân lập từ các ổ dịch tự nhiên.
* Phôi vịt
- Phôi vịt 12 - 13 ngày tuổi, khoẻ mạnh, đ−ợc lấy từ đàn vịt bố mẹ khỏe mạnh ch−a tiêm phòng vacxin viêm gan vịt.
* Động vật thí nghiệm
- Vịt con 7 ngày tuổi khoẻ mạnh ch−a đ−ợc tiêm kháng thể hoặc vacxin phòng bệnh viêm gan vịt, đ−ợc nở từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh, ch−a đ−ợc tiêm phòng vacxin viêm gan vịt.
- Vịt con 1 - 7 ngày tuổi khoẻ mạnh, nở từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh đ−ợc tiêm phòng vacxin viêm gan vịt 3 lần.
- Vịt giống nuôi từ các hộ gia đình của địa ph−ơng.
- Vịt con ốm chết vì bệnh tại các ổ dịch ở địa ph−ơng để phân lập virus.
* Môi tr−ờng kiểm tra
Thạch th−ờng, thạch máu, n−ớc thịt, thạch Sabouraud.
* Các trang thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Buồng cấy vô trùng. - Tủ ấm. - Nồi hấp −ớt. - Tủ lạnh âm sâu - 860C - Máy li tâm. - Đèn soi trứng. - Tủ sấy khô. * Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm - Bình tam giác - ống nghiệm - Cối chày sứ…
3.3. ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Ph−ơng pháp điều tra tình hình chăn nuôi vịt, tình hình bệnh viêm gan vịt do virus ở huyện Hiệp Hoà - Bắc Giang gan vịt do virus ở huyện Hiệp Hoà - Bắc Giang
- Thu thập thông tin từ chủ hộ chăn nuôi và mạng l−ới thú y cơ sở.
- Theo dõi trực tiếp các đàn vịt, xác định bệnh dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan vịt.
- Dựa vào các số liệu thu thập đ−ợc từ trạm thú y, trạm khuyến nông, phòng thống kê huyện.
3.3.2. Ph−ơng pháp phân lập virus viêm gan vịt
* Xử lí bệnh phẩm:
Lấy bệnh phẩm là gan của vịt con mắc bệnh tự nhiên có triệu chứng, bệnh tích đặc tr−ng của bệnh viêm gan do virus ở vịt. Đem nghiền gan với n−ớc sinh lý thành huyễn dịch 1/5, làm đông tan 3 lần. Xử lý huyễn dịch bằng kháng sinh (penicillin + streptomycin), để huyễn dịch ở nhiệt độ 40C trong vòng 2 giờ. Ly tâm huyễn dịch với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 15 phút, lấy phần trên đem xử lý bằng Chloroform 5% trong vòng 10 phút để diệt virus khác không phải là virus viêm gan vịt. Ta đ−ợc huyễn dịch bệnh phẩm dùng để phân lập.
* Phân lập virus viêm gan vịt trên phôi vịt
Thí nghiệm đ−ợc bố trí làm 3 lần, mỗi lần 35 phôi vịt 13 ngày tuổi, khoẻ mạnh, chia làm hai lô: 25 phôi cho lô thí nghiệm, 10 phôi cho lô đối chứng.
- Lô thí nghiệm: Mỗi phôi tiêm 0,1 ml huyễn dịch bệnh phẩm vào
xoang niệu mô.
- Lô đối chứng: Mỗi phôi tiêm 0,1 ml n−ớc sinh lý.
Sau khi tiêm 18 giờ, soi kiểm tra ngày 3 lần, theo dõi thời gian chết phôi. Những phôi chết và sống đều tiến hành mổ phôi, kiểm tra bệnh tích đại thể.
Sự có mặt của virus đ−ợc đánh giá dựa vào sự nhân lên của virus trên phôi, virus gây chết phôi và các bệnh tích đặc tr−ng trên phôi.
* Phân lập virus viêm gan vịt trên vịt con
Thí nghiệm đ−ợc bố trí làm 3 lần, mỗi lần dùng 35 con vịt con 7 ngày tuổi, khoẻ mạnh, đ−ợc nở từ trứng của đàn vịt bố mẹ khoẻ mạnh, không nằm trong ổ dịch, ch−a đ−ợc tiêm kháng thể hoặc vacxin viêm gan vịt, chia làm 2 lô: 25 vịt con cho lô thí nghiệm, 10 vịt con cho lô đối chứng.
- Lô thí nghiệm: Mỗi vịt thí nghiệm tiêm 0,5 ml huyễn dịch bệnh phẩm, tiêm bắp.
- Lô đối chứng: Vịt không tiêm bệnh phẩm, tiêm 0,5 ml n−ớc sinh lý. Sau khi tiêm, tiến hành theo dõi vịt trong vòng 10 ngày, quan sát biểu hiện của vịt, ghi thời gian vịt chết, cả vịt sống và chết đều mổ khám quan sát bệnh tích đại thể.
Đánh giá sự có mặt của virus viêm gan vịt dựa vào các triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan vịt.
3.3.3. Ph−ơng pháp xác định typ của virus viêm gan vịt phân lập
Thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên vịt con 7 ngày tuổi. Vịt chia làm 3 lô, mỗi lô 25 con.
- Lô thí nghiệm: Mỗi vịt tiêm 2 ml kháng huyết thanh viêm gan vịt typ I vào d−ới da. Sau khi tiêm 24 giờ, tiêm virus viêm gan vịt (chủng cần định typ) với liệu 103,3LD50 cho mỗi vịt. Tiêm d−ới da.
- Lô đối chứng d−ơng: Mỗi vịt tiêm 2ml kháng huyết thanh viêm gan vịt typ I. Tiêm d−ới da.
- Lô đối chứng âm: Mỗi vịt tiêm virus viêm gan vịt với liều 103,3 LD50 cho một vịt. Tiêm d−ới da.
Sau khi tiêm theo dõi vịt trong thời gian 14 ngày. Virus viêm gan vịt đ−ợc xác định thuộc typ I khi ở lô thí nghiệm có 80 - 100% vịt sống sót. ở lô đối chứng âm có 80 - 100% vịt chết với triệu chứng và bệnh tích của bệnh viêm gan vịt.
3.3.4. Ph−ơng pháp xác định chỉ số ELD50(Embryo lethal dose) của chủng virus viêm gan vịt phân lập đ−ợc virus viêm gan vịt phân lập đ−ợc
* Chuẩn bị:
- Chuẩn bị virus: Virus đ−ợc lấy từ mẫu phân lập trên phôi vịt 13 ngày tuổi và trên vịt con có triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan vịt. Pha loãng virus với n−ớc sinh lý theo cơ số 10 từ 10-1 đến 10-26.
- Chuẩn bị trứng: Trứng vịt ấp ở 370C đến ngày thứ 13 đem soi trứng, chọn những quả có phôi khoẻ mạnh, đánh dấu buồng hơi và vị trí phôi. Trứng đựơc sát trùng bằng cồn 700, sát trùng buồng hơi bằng cồn Iod 5%.
* Tiến hành:
- Mỗi nồng độ virus tiêm cho 4 phôi với liều 0,1ml/phôi vào xoang niệu mô. - 4 phôi không tiêm virus, tiêm 0,1ml n−ớc sinh lý làm đối chứng.
- Sau khi tiêm theo dõi 96 giờ, phôi chết cho vào tủ lạnh 40C trong 24 giờ, tiến hành mổ phôi quan sát bệnh tích phôi.
- Ghi kết quả phôi chết, phôi sống ở mỗi nồng độ.
* Tính toán kết quả:
Tính chỉ số ELD50 theo công thức của Reed - Muench: lgELD50= lgA + X. lg f X = ' B ' A ' A 50 − − Trong đó: X là khoảng cách tỷ lệ.
A là độ pha loãng virus cận trên 50%.
A' là tỷ lệ phần trăm số phôi chết cận trên 50%. B' là tỷ lệ phần trăm số phôi chết cận d−ới 50%. f là bậc pha loãng của virus.
3.3.5. Ph−ơng pháp xác định chỉ số EID50(Embryo Infective Dose) của chủng virus viêm gan vịt phân lập đ−ợc chủng virus viêm gan vịt phân lập đ−ợc
* Chuẩn bị:
Chuẩn bị virus và trứng để xác định chỉ số EID50 t−ơng tự nh− ở phần 3.3.4
* Tiến hành:
- Mỗi nồng độ virus tiêm cho 4 phôi, mỗi phôi tiêm 0,1ml vào xoang niệu mô. - 4 phôi không tiêm virus, tiêm 0,1ml n−ớc sinh lý làm đối chứng.
- Sau khi tiêm trứng tiến hành theo dõi đến 96 giờ những phôi chết đ−ợc cất vào tủ lạnh 40C.
- Sau 96 giờ mổ trứng quan sát bệnh tích ở tất cả các phôi, phôi có những bệnh tích của bệnh viêm gan vịt (phôi xuất huyết, phù phôi, gan phôi xuất huyết) đ−ợc đánh giá là phôi nhiễm.
- Ghi kết quả phôi nhiễm và không nhiễm ở các nồng độ.
* Tính toán kết quả:
Tính chỉ số EID50 theo công thức của Reed - Muench:
3.3.6. Ph−ơng pháp xác định chỉ số LD50 (Lethal Dose) của chủng virus viêm gan vịt phân lập đ−ợc. viêm gan vịt phân lập đ−ợc.
* Chuẩn bị:
- Chuẩn bị vịt con: Vịt con 7 ngày tuổi, khỏe mạnh, ch−a đ−ợc tiêm kháng thể hoặc vacxin viêm gan vịt, nở từ trứng của đàn vịt bố mẹ ch−a đ−ợc tiêm vacxin viêm gan vịt.
- Chuẩn bị virus: Virus đ−ợc lấy từ mẫu phân lập trên phôi vịt 13 ngày tuổi và trên vịt con có triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm gan vịt. Pha loãng virus với n−ớc sinh lý theo cơ số 10 từ 10-1 đến 10-18.
* Tiến hành:
- Mỗi nồng độ tiêm cho 5 vịt con, với liều 0,5 ml/con, tiêm bắp. - 5 vịt đối chứng không tiêm virus, tiêm 0,5 ml n−ớc sinh lý.
- Sau khi tiêm tiến hành theo dõi trong vòng 10 ngày. Trong quá trình theo dõi, quan sát các biểu hiện của vịt, theo dõi thời gian chết của vịt.
- Ghi kết quả vịt sống, vịt chết theo từng nồng độ.
* Tính toán kết quả:
Tính chỉ số LD50 theo công thức của Reed - Muench:
3.3.7. Ph−ơng pháp xác định miễn dịch thụ động với bệnh viêm gan vịt của đàn vịt con nở từ trứng của đàn vịt mẹ đã đ−ợc gây miễn dịch của đàn vịt con nở từ trứng của đàn vịt mẹ đã đ−ợc gây miễn dịch
* Chuẩn bị
- Vacxin viêm gan vịt:
Chủng nh−ợc độc DH - EG - 2000 do Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý cung cấp.
- Virus viêm gan vịt c−ờng độc:
Chủng virus viêm gan vịt c−ờng độc phân lập ở Hiệp Hoà - Bắc Giang có LD50 = 10-15,33/0,5 ml.
- Vịt thí nghiệm:
Vịt con 7 ngày tuổi khoẻ mạnh, nở từ trứng của đàn vịt mẹ đã gây miễn dịch (tiêm 3 lần vacxin tr−ớc khi đẻ ở các thời điểm: 12 tuần, 8 tuần, 4 tuần).
- Vịt đối chứng:
Vịt con 7 ngày tuổi, khoẻ mạnh, nở từ trứng của đàn vịt mẹ không đ−ợc gây miễn dịch.
* Tiến hành:
Thí nghiệm đ−ợc tiến hành 3 lần. + Lần 1:
- Vịt thí nghiệm: 25 vịt con, nở từ trứng của đàn vịt mẹ có miễn dịch khi đẻ đ−ợc 1 tháng.
- Vịt đối chứng: 25 con.
+ Lần 2:
- Vịt thí nghiệm: 25 vịt con, nở từ trứng của đàn vịt mẹ có miễn dịch khi đẻ đ−ợc 2 tháng.
- Vịt đối chứng: 25 con. + Lần 3:
- Vịt thí nghiệm: 25 vịt con, nở từ trứng của đàn vịt mẹ có miễn dịch khi đẻ đ−ợc 4 tháng.
- Vịt đối chứng: 25 con
ở mỗi lần thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt c−ờng độc tiêm cho vịt thí nghiệm và vịt đối chứng, mỗi con với liều 103,33LD50, tiêm d−ới da.
Sau khi tiêm, theo dõi vịt trong thời gian 14 ngày. Vịt sống sót đ−ợc đánh giá có miễn dịch thụ động và đ−ợc bảo hộ với bệnh viêm gan vịt.
3.3.8. Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu thu đ−ợc, đ−ợc xử lý theo ph−ơng pháp thống kê sinh học.
4. kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.1. Tình hình chăn nuôi vịt ở huyện Hiệp Hoà - Bắc Giang
Bắc Giang là tỉnh miền núi có nền kinh tế với hơn 80% dân số sống bằng nghề nông. Tuy là một tỉnh miền núi nh−ng Bắc Giang cũng có diện tích mặt n−ớc khá lớn bao gồm hệ thống sông ngòi, ao hồ, ruộng ngập n−ớc cho phép phát triển ngành chăn nuôi thủy cầm.
Ngoài thuận lợi chung của tỉnh, huyện Hiệp Hòa có sông Cầu bao bọc, hệ thống m−ơng máng rộng, trữ l−ợng n−ớc lớn đ−ợc xây dựng từ thời Pháp. Hiệp Hòa là trung tâm giao l−u kinh tế và văn hóa giữa Bắc Giang với các tỉnh lân cận nh−: Bắc Ninh, Thái Nguyên, Hà Nội. Đây chính là điều kiện thuận lợi cho phát triển kinh tế nói chung và chăn nuôi nói riêng.
Ngành chăn nuôi của huyện Hiệp Hòa trong những năm gần đây cũng luôn nhận đ−ợc sự quan tâm đầu t− để phát triển. Năm 2004 tỷ trọng ngành chăn nuôi đã đạt 44,4% sản xuất nông nghiệp.
Theo Thống kê của huyện năm 2003 huyện có 173.453 con vịt. Sau do ảnh h−ởng dịch cúm gia cầm, công tác chăn nuôi nói chung và chăn nuôi vịt bị giảm xuống rõ rệt. Tính đến ngày 01/01/2005 toàn huyện có 32.900 con trâu bò, 135.000 con lợn và 1.061.000 con gia cầm trong đó vịt có 157.815 con.
Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã tiến hành điều tra tình hình chăn nuôi vịt ở 25 xã và 1 thị trấn của cả huyện Hiệp Hòa. Kết quả thu đ−ợc trình bày ở bảng 4.1.a và 4.1.b.
Bảng 4.1a. Tình hình chăn nuôi vịt của các hộ chăn nuôi huyện Hiệp Hòa - tỉnh Bắc Giang
(Tính đến 1/1/2005)
Quy mô chăn nuôi
<100 con 100 - 200 con > 200 con
STT Xã Số hộ chăn nuôi vịt Số hộ Tỷ lệ (%) Số hộ Tỷ lệ (%) Số hộ Tỷ lệ (%) Số l−ợng vịt thịt (con) Số l−ợng vịt đẻ (con) Tổng số vịt 1 Mai Trung 86 43 50,00 30 34,88 13 15,12 5576 1416 6992 2 Châu Minh 78 42 53,85 26 33,33 10 12,82 4858 1120 5978 3 H−ơng Lâm 64 28 43,75 22 34,38 14 21,88 5059 1701 6760 4 Đoan Bái 62 36 58,06 18 29,03 8 12,90 3765 1055 4820 5 Danh Thắng 58 22 37,93 20 34,48 16 27,59 4086 1500 5586 6 Th−ờng Thắng 62 24 38,71 24 38,71 14 22,58 5840 886 6726 7 Hoàng An 50 20 40,00 16 32,00 14 28,00 4685 819 5504 8 Hòa Sơn 60 31 51,67 19 31,67 10 16,67 3919 1190 5109 9 Quang Minh 48 18 37,50 19 39,58 11 22,92 3836 1350 5186 10 Ngọc Sơn 85 37 43,53 34 40,00 14 16,47 5361 2405 7766 11 Thanh Vân 72 37 51,39 19 26,39 16 22,22 5037 1805 6842 12 Hoàng Vân 68 36 52,94 16 23,53 16 23,53 5095 1465 6560 13 Đồng Tân 38 18 47,37 11 28,95 9 23,68 3312 1008 4320 14 Hợp Thịnh 60 30 50,00 13 21,67 17 28,33 4324 1640 5964 Tổng 891 422 47,36 287 32,21 182 20,43 64753 19360 84113
Bảng 4.1b. Tình hình chăn nuôi vịt của các hộ chăn nuôi huyện Hiệp Hòa - tỉnh Bắc Giang Quy mô chăn nuôi
<100 con 100 - 200 con > 200 con Số TT Xã Số hộ chăn nuôi vịt Số hộ Tỷ lệ (%) Số hộ Tỷ lệ (%) Số hộ Tỷ lệ (%) Số l−ợng vịt thịt (con) Số l−ợng vịt đẻ (con) Tổng số vịt 15 Bắc Lý 72 16 22,22 40 55,56 16 22,22 6872 1601 8473 16 Đức Thắng 50 12 24,00 28 56,00 10 20,00 4509 1204 5713 17 Xuân Cẩm 64 16 25,00 35 54,69 13 20,31 6620 1068 7688 18 Mai Đình 58 12 20,69 32 55,17 14 24,14 6139 2653 8792 19 Thị trấn Thắng 12 3 25,00 6 50,00 3 25,00 1075 293 1368 20 Hùng Sơn 46 9 19,57 25 54,35 12 26,09 4105 1031 5136 21 Đông Lỗ 85 24 28,24 43 50,59 18 21,18 7363 2458 9821 22 Hoàng L−ơng 44 11 25,00 21 47,73 12 27,27 3986 1124 5110 23 Thái Sơn 41 11 26,83 21 51,22 9 21,95 3943 981 4924 24 L−ơng Phong 67 20 29,85 35 52,24 12 17,91 6139 1653 7792 25 Đại Thành 26 8 30,77 14 53,85 4 15,38 2240 724 2964 26 Hoàng Thanh 49 11 22,45 27 55,10 11 22,45 4743 1178 5921 Tổng hợp 614 153 24,92 327 53,26 134 21,82 57734 15968 73702 Chuyển tổng bảng 4a 891 422 47,36 287 32,21 182 20,43 64753 19360 84113 Tổng 1505 575 38,20 614 40,80 316 21,00 122487 35328 157815
Qua bảng 4.1.a và 4.1.b, tính đến thời điểm 1.1.2005 toàn huyện Hiệp Hòa có 1505 hộ chăn nuôi vịt, với tổng số vịt nuôi 157.815 con trong đó vịt nuôi thịt 122.487 con chiếm 77,6%, vịt nuôi đẻ trứng 35328 con chiếm 22,4%. Các giống vịt đang nuôi tại Hiệp Hòa: vịt cỏ, vịt bầu, các giống vịt lai và gần đây xuất hiện giống vịt cao sản cho năng suất cao nh−, vịt siêu thịt (CV.super), Khaki cambell....
Cũng qua điều tra cho thấy qui mô chăn nuôi vịt ở huyện Hiệp Hòa chủ yếu là vừa và nhỏ. Số hộ chăn nuôi d−ới 100 con có 575 hộ chiếm tỷ
