độc tố với huyết thanh chuột đợc miễn dịch giải độc tố.
Để phân tích thêm về độc tố E. coli trong hỗn hợp độc tố, chúng tôi tiến hành phản ứng ADP theo kỹ thuật Owchterlony. Thành phần tham gia phản ứng gồm có, kháng nguyên độc tố đợc bố trí ở giếng trung tâm, còn các giếng xung quanh là huyết thanh chuột miễn dịch đợc pha loãng theo cấp số 2. Kết quả đợc trình bày ở bảng 19.
Bảng 19: Phản ứng ADP giữa kháng nguyên độc tố E. coli đơn giá và đa giá với huyết thanh chuột miễn dịch giải độc tố E. coli
(hiệu giá huyết thanh đa giá kháng độc tố E. coli)
Kháng
nguyên Định tính
Hiệu giá
kết tủa Đối chứng 1 Đối chứng 2
T2Hanco 1 + 1/4 - - T2Hanco 2 + 1/8 - - T2Hanco 3 + 1/4 - - T2Hanco 4 + 1/8 - - T2Hanco 5 + 1/4 - - T2Hanco 6 + 1/8 - - T2Hanco 7 + 1/4 - - T2Hanco 8 + 1/8 - -
T2Hanco 9 + 1/4 - -
T2Hanco 10 + 1/8 - -
T2 Poli + 1/16 - -
* Đối chứng 1: Huyết thanh kháng E. coli + Môi trờng Đối chứng 2: Huyết thanh âm tính + Độc tố
Hình 4. Phản ứng ADP giữa độc tố T2 với kháng huyết thanh
Phản ứng ADP dơng tính một lần nữa khẳng định chắc chắn về tính kháng nguyên của độc tố, ngoài ra ta còn xác định đợc hiệu giá kết tủa, nghĩa là kháng nguyên độc tố gây miễn dịch mạnh.
Kết quả của các phản ứng huyết thanh trên cho thấy:
+ Giải độc tố E. coli có tính kháng nguyên tốt, đã kích thích đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch.
+ Kháng độc tố trong huyết thanh chuột đợc miễn dịch giải độc tố có thể đợc phát hiện qua phản ứng kết tủa với kháng nguyên độc tố E. coli trong ống nghiệm, qua phản ứng ADP trong gel thạch. Qua hai phản ứng đó có thể xác định đợc hiệu giá của kháng độc tố.
+ Mỗi chủng E. coli có khả năng sản sinh độc tố với hàm lợng khác nhau. Độc tố đa giá mạnh hơn và gây miễn dịch tốt hơn độc tố đơn giá.
Chúng tôi sử dụng các chất bổ trợ: ISA và IMS của hãng Septic, Al(OH)3 và alum của SPI Pharma. Mỗi chất bổ trợ đợc bổ sung vào dịch nuôi chứa độc tố đã đợc bất hoạt và giải độc (gọi là tắt là kháng nguyên) với tỷ lệ thích hợp. Trớc tiên chúng tôi tiến hành thử an toàn trên động vật thí nghiệm là chuột bạch 18 – 20 gam. Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 20.
Bảng 20: Tính an toàn của kháng nguyên có chứa các chất bổ trợ khác nhau
Kháng nguyên có chất bổ trợ
Tỷ lệ chuột chết/tiêm theo đờng tiêm
Kết luận
Dới da (1 ml) Phúc xoang (0,5)
Nhũ hóa ISA 6/10 7/10 Không đạt
Nhũ hóa IMS 4/10 4/10 Không đạt
AL(OH)3 0/10 0/10 Đạt
Alum 0/10 0/10 Đạt
Từ kết quả thử an toàn, chúng tôi nhận thấy 2 sản phẩm có bổ trợ Al(OH)3 và alum khi bổ sung vào kháng nguyên E. coli an toàn hơn so với sản phẩm có bổ trợ dầu khoáng ISA, IMS. Từ đây chúng tôi sử dụng 2 sản phẩm này để tiếp tục nghiên cứu hiệu lực trên động vật thí nghiệm là chuột bạch.
Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu hiệu lực của hai sản phẩm trên bằng cách miễn dịch liều 0,4ml/con theo đờng tiêm dới da trên chuột bạch và so sánh với đối chứng (đối chứng là chuột miễn dịch kháng nguyên không có chất bổ trợ). Sau khi tiêm 21 ngày, tiến hành lấy máu chuột, chắt huyết thanh, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngng kết nhanh trên phiến kính. Kết quả cụ thể nh sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 21: Kiểm tra tính miễn dịch của kháng nguyên có bổ sung các chất bổ trợ
Chất bổ trợ Nồng độ Hiệu giá từng con Hiệu giá trung bình
Al(OH)3 10/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/128 1/115,2 20/00 1/256 1/128 1/256 1/256 1/128 1/204,8 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/128 1/179,2 40/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 Alum 0.50/00 1/128 1/64 1/128 1/128 1/64 1/102,4 10/00 1/256 1/128 1/128 1/256 1/128 1/179,2 20/00 1/128 1/512 1/128 1/256 1/128 1/230,4
30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4
Đối chứng (không có
chất bổ trợ) 1/128 1/64 1/64 1/128 1/128 1/102,4
Nhìn chung chuột đợc miễn dịch bằng kháng nguyên có chất bổ trợ có hiệu giá kháng thể cao hơn so chuột đối chứng, cụ thể:
Đối với chất bổ trợ là Al(OH)3 ở mỗi nồng độ khác nhau thì gây ra đáp ứng miễn dịch khác nhau trên động vật thí nghiệm. Trong đó nồng độ 20/00 cho kết quả tốt nhất thể hiện qua hiệu giá kháng thể của huyết thanh chuột là cao nhất (hiệu giá trung bình đạt 1/204,8). Nồng độ tối u của chất bổ trợ alum cũng là 20/00 (hiệu giá trung bình đạt 1/230,4).
Từ những kết quả trên, chúng tôi quyết định chọn alum bổ sung với nồng độ 2 0/00 làm chất bổ trợ cho kháng nguyên và sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.5. Nghiên cứu tính an toàn của kháng nguyên
Sau khi đã chọn đợc chất bổ trợ thích hợp là alum 20/00 chúng tôi sản xuất 3 lô liên tục để khảo sát tính an toàn của kháng nguyên này trên nhiều loại động vật khác nhau: chuột lang 250 - 300 gam , thỏ 1800 - 2000 gam và bản động vật là gà hậu bị. Mỗi loài động vật có một liều lợng kháng nguyên khác nhau, đờng đa thuốc vào là tiêm dới da, riêng đối với gà đờng đa thuốc vào là tiêm bắp. Sau khi tiêm, chúng tôi tiến hành theo dõi các phản ứng của động vật thí nghiệm và số lợng động vật bị chết trên tổng số động vật đợc tiêm. Kết quả thí nghiệm đợc thống kê ở bảng 22.
Qua bảng kết quả, chúng tôi thấy rằng với công thức chế tạo là kháng nguyên + alum 2 0/00, khi tiến hành thử an toàn với ba lô sản xuất khác nhau, đều cho kết quả an toàn trên các động vật thí nghiệm. Cụ thể là không có trờng hợp nào động vật thí nghiệm bị chết hoặc hoặc phản ứng với chế phẩm.
Bảng 22: Kết quả thử tính an toàn của các lô kháng nguyên trên động vật
Lô thí nghiệm Số chuột lang phản ứng /số tiêm Số thỏ phản ứng/số tiêm Số gà phản ứng/số tiêm
Liều dd (ml) Liều dd (ml) Liều dd (ml) Liều tiêm bắp (ml) 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3,0 2,0 3,0 4,0 2,0 3,0 4,0 Lô 1 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/7 0/8 0/8 0/8 0/8 0/7 ĐC lô 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/5 0/4 Lô 2 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/6 0/6 0/7 0/7 0/7 0/7 ĐC lô 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Lô 3 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/9 ĐC lô 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Tổng TN 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/21 0/22 0/23 0/23 0/23 0/23 Tổng ĐC 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/11 0/12 0/12 0/12 0/13 0/12
Ghi chú: Động vật không có phản ứng khi đợc tiêm chế phẩm. Đối chứng:Môi trờng + formol 30/00 + alum 20/00
3.6. Nghiên cứu tính miễn dịch của kháng nguyên và nghiên cứu thời gian sản sinh miễn dịch sau khi tiêm
Để nghiên cứu tính miễn dịch và thời gian tạo miễn dịch, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên chuột bạch 18-20 gam, với số lợng là 40 con cho một lần thí nghiệm. Cứ một tuần sau khi miễn dịch, tiến hành lấy máu 10 con để kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu của các chuột thí nghiệm. Thí nghiệm đợc lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm cụ thể nh sau:
Bảng 23: Tính miễn dịch và thời gian tạo miễn dịch
Tiêm dới da 0,4ml/con
HGKT trung bình trong huyết thanh chuột sau tiêm