Hiện nay ngời ta dùng phơng pháp PCR để xác định các gen độc tố của E. coli, đây là phơng pháp u việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó.
- Cách tiến hành:
+
ADN mẫu: khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trờng thạch máu ở 370C/24h. + Hỗn hợp phản ứng PCR:Primers: 1 àl mỗi loại Dung dịch đệm (5 X): 5,0 àl
Enzym (Taq polymerase): 0,5 àl
Nớc khử ion vừa đủ để đạt đợc thể tích cuối cùng là 25àl cho 1 phản ứng.
+
Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bớc và đợc thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo bảng 1.+
Chạy điện di: sản phẩm PCR thu đợc sau chu trình phản ứng đợc nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), đợc trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR đợc chạy điện di trên thạch agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút.+
Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di đợc nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium bromide (1àl/ml) trong vòng 15 phút đọc kết quả.Bảng 1: Chu trình của phản ứng PCR
Thành phần
Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) ADN khuôn, primer, Taq polymerase, dNTP 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 - Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh đợc và ghi nhận lại. Kích thớc các băng ADN đợc so sánh với ADN chuẩn (ADN marker).
