và ph−ơng pháp nghiên cứu
2.1. Nội dung
2.1.1. Điều tra một số chỉ tiêu liên quan đến chăn nuôi và dịch cúm gia cầm của tỉnh Bắc Ninh
- Tình hình chăn nuôi, sản l−ợng trứng, sản l−ợng thịt của gia cầm từ năm 2001 đến năm 2006.
- Thiệt hại do dịch cúm gia cầm trong năm 2004 - 2005.
- Kế hoạch tiêm phòng vaccine cúm cho đàn gia cầm trong năm 2005 - 2006.
2.1.2. Giám một số chỉ tiêu của đàn gia cầm sau tiêm phòng vaccne tại tỉnh Bắc Ninh
- Giám sát lâm sàng: theo dõi độ an toàn của vaccine, ảnh h−ởng của vaccine đến tỷ lệ đẻ của đàn gia cầm.
- Giám sát huyết thanh và giám sát virus:
+ Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gà tại các thời điểm 1 tháng, 3 tháng và 5 tháng sau tiêm vaccine.
+ Biến động hiệu giá kháng thể của đàn gà sau khi tiêm vaccine.
+ Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn vịt tại thời điểm 1 tháng, 3 tháng sau tiêm vaccine mũi 3.
+ Biến động hiệu giá kháng thể của đàn vịt sau khi tiêm vaccine.
+ Kiểm tra sự l−u hành của virus cúm H5N1 trên đàn gà, vịt đ−ợc tiêm vaccine.
Sơ đồ giám sát huyết thanh và virus (-) (+) (-) (+) Mẫu bệnh phẩm Phát hiện virus Phát hiện kháng thể(HI) Kết luận Phân lập lần 2 Phân lập virus RT-PCR (RRT-PCR) Giám định (HI) Phân lập virus Huyết thanh Dịch swab
2.2. Nguyên liệu 2.2.1. Đối t−ợng kiểm tra
Gà, vịt đv đ−ợc tiêm phòng vaccine cúm trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh.
2.2.2. Vaccine
Vaccine vô hoạt subtype H5N1, chủng Re - 1 (A/Harbin/Re - 1/2003), subtype H5 (H5N2), chủng N28 (A/Turkey/Englan/N28/1973).
2.2.3. Các hoá chất dùng trong xét nghiệm
* Môi tr−ờng và hoá chất bảo quản bệnh phẩm
- Môi tr−ờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bò) có bổ sung kháng sinh. Penicillin G 2.000.000U/l Streptomycin 200 mg/l Polymyxin B 2.000.000 U/l Gentamicin 250 mg/l Nystatin 500.000 U/l Ofloxacin HCl 60 mg/l Sulfmethoxasole 200 mg/l - Môi tr−ờng Glycerol Pha chế PBS NaCL 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g N−ớc cất vđ 1000 ml
Hấp vô trùng 121oC/ 15 phút, bổ sung kháng sinh có trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1.
* Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh
- Dung dich PBS 0,01M pH7.2
Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4..H2O 0,316 g
Na Cl 8,5 g
N−ớc cất 1 lit
Chỉnh pH = 7.2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch n−ớc muối sinh lý 0,85%:
8,5 gNaCl trong 1 lít n−ớc cất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hấp vô trùng, bảo quản 4oCkhông quá 3 tuần.
- Dung dịch hồng cầu gà 1%:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đv tr−ởng thành, không có kháng thể cúm vànewcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10mlhút sẵn 1ml (10% thể tích)dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%)rồi lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm.
+Ly tâm1000 - 1500vòng/phút,trong 15 phút,đổ bỏ huyết t−ơng, cho thêm n−ớc sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu,lắc đều. Ly tâm nh− trên 3- 4 lần để rửa hồng cầu,sau lần ly tâm cuối hút bỏ n−ớc ở trên.
+ Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha1 ml hồng cầu với 99 mln−ớc muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày(nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyếtloại bỏ không dùng).
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn trên các loàinh− thỏ, dê, cừu...cần đ−ợc xử lý bằng RDE(Receptor Destroying Enzyme) tr−ớc khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chế trên gàkhông cần xử lý bằngRDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là d−ơng tính.
-Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý kháng huyết thanh vô hoạt yếu tố ức chế đặc hiệu.
- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh ủ ở nhiệt độ 37oC trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.
- ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30phút để vô hoạt RDEcòn d−.
- Kháng huyết thanh đv xử lý để nguội cho thêm 6 phần n−ớc sinh lý
(0,3ml HT + 1,8ml SL),độ pha lovng cuối cùng củakháng huyết thanh là 1/10. 2.2.4. Các trang thiết bị và cơ sở vật chất
Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của phòng virus, Trung tâm Chẩn đoán Thú y, Cục Thú y [8].
2.3. Ph−ơng Pháp nghiên cứu 2.3.1. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian đ−ợc tiến hành: từ tháng 12 năm 2005 đến tháng 10 năm 2006. Địa điểm: Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, Chi cục Thú y Bắc Ninh, một số hộ chăn nuôi của tỉnh Bắc ninh.
2.3.2. Điều tra một số chỉ tiêu liên quan đến chăn nuôi và dịch cúm gia cầm của tỉnh Bắc Ninh
2.3.2. Giám sát một số chỉ tiêu của đàn gia cầm sau tiêm phòng vaccine của tỉnh Bắc Ninh
Dựa theo h−ớng dẫn qui chế giám sát sau tiêm phòng, chúng tôi tiến hành giám sát đàn gia cầm sau khi tiêm vaccine ngoài thực địa [6].
2.3.2.1. Giám sát lâm sàng:
- Khảo sát độ an toàn của vaccine đối với đàn gia cầm sau mỗi lần tiêm phòng, chúng tôi tiến hành theo dõi thông qua điều tra trực tiếp hai đàn gà và một đàn vịt thuộc 3 huyện trên địa bàn tỉnh.
- Khảo sát ảnh h−ởng của vaccine đến tỷ lệ đẻ trứng của đàn gia cầm, chúng tôi tiến hành theo dõi thông qua điều tra trực tiếp hàng tuần trên một đàn gà và một đàn vịt.
2.3.2.2. Giám sát huyết thanh, giám sát virus
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gà trên toàn tỉnh đ−ợc tiêm vaccine tại các thời điểm sau khi tiêm: 1 tháng, 3 tháng và 5 tháng.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn vịt trên toàn tỉnh sau khi đ−ợc tiêm vaccine mũi 3 (mũi 1 của năm 2006 đ−ợc tiêm sau mũi 2 của năm 2005 là 4 tháng) tại các thời điểm 1 tháng và 3 tháng.
Nhóm gà vịt đ−ợc tiêm vaccine mũi 3 lấy trung bình 30 mẫu/huyện, nhóm gà chỉ báo lấy trung bình 30 mẫu/tỉnh.
- Khảo sát diễn biến kháng thể kháng virus cúm, sự l−u hành của virus trên nhóm gà 15 con đ−ợc bắt ngẫu nhiên sau khi tiêm phòng vaccine vào các thời điểm: 0, 4, 6, 8, 12, 16 và 20 tuần.
- Khảo sát diễn biến kháng thể, sự l−u hành của virus trên đàn vịt 15 con đ−ợc bắt ngẫu nhiên sau khi tiêm phòng vaccine vào các thời điểm: 0, 4, 6, 8, 12 và 16 tuần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Giám sát sự cảm nhiễm và l−u hành của virus trên đàn gia cầm trong toàn tỉnh đ−ợc tiêm vaccine vào các thời điểm 1 tháng, 3 tháng và 5 tháng.
Nhóm gà vịt đ−ợc tiêm vaccine lấy 60 mẫu/lần, đàn gia cầm chỉ báo lấy 30 mẫu/lần.
2.3.2.3. Lấy mẫu
- Dịch ngoáy ổ nhớp: cho que ngoáy sâu vào hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn, đ−a vào ống dung dịch bảo quản nh− trên.
- Mẫu huyết thanh: lấy 3 - 5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh.
Bệnh phẩm sau khi cho vào dung dịch vận chuyển có thể bảo quản ở 4oC từ1 - 2 ngày,nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ - 20oC.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 4oCtrong vòng một tuần, nếu bảo quản lâu hơn,giữ ở nhiệt độ - 20oC.
Mẫu đ−ợc vận chuyển tới phòng xét nghiệm trong điều kiện lạnh (phích đá)càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
2.3.2.4. Phản ứng ng−ng kết hồng cầu HA
- Nhỏ 25 àlPBS 0,01M vào đĩaTakashi 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl dịch niệu mô (dịch niệu mô đ−ợc chế từ ph−ơng pháp cấy truyền bệnh phẩm qua phôi chứng 9 - 10 ngày tuổi và đ−ợc trình bày trong phần sau) vào giếng thứ 1.
- Pha lovng kháng nguyên bằng cách chuyển 25 àl dịch niệu mô từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11thì bỏ đi 25 àl.
- Nhỏ thêm25 àl PBSvào các giếng.
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay
- Để đĩa Takashi ở nhiệt độ phòng20oC,thời gian khoảng 20 - 30 phút.
cao nhất còn có hiện t−ợng ng−ng kết hồng cầu.
Ví dụ: Nếu ở nhiệt độ pha lovng 1/128 còn có ng−ng kết thì hiệu giá HA là 1/128.
+ Nếu HA (+) dương tính,chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩnNewcastle để xác định loại virusphân lập.
+ NếuHA (-) âm tính,phôi chết,có bệnh tích phôi, lấy n−ớc trứng tiêm truyền lần 2.
+ Nếu HA (-)âm tính,phôi phát triển bình th−ờng.Để chẩn đoán chính xác hơn lấy dịch liệu mô lần 1 cấy truyền qua phôi gà 9 - 10 ngày lần 2 và làm nh− lần 1 hoặc có thể không làm tiếp và kết luận là không có virus.
Bảo quản virus phân lập đ−ợc ở -70oC.
2.3.2.5. Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu HI
- Pha kháng nguyên 4HA/25 àl: lấy độ pha lovng cuối cùng có phản ứngng−ng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: trên 1 đĩa Takashi có thể tiến hành phản ứng HIvới nhiều kháng huyết thanh của các subtypekhác nhau.
+ Nhỏ25 àl PBSvào các giếng của đĩa Takashi.
+ Nhỏtiếp 25 àlkháng huyết thanh vào giếng đầu tiên.
+ Pha lovng kháng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl kháng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi25
àlcuối cùng.
+ Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA đv chuẩn bị vào các giếng từ giếng
1 - 11. Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng12). + Lắc đĩa và để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nhỏ25 àldung dịch hồng cầu (1%) vào rất cả các giếngcủa đĩa. + Lắc đều để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút,đọc kết quả.
- Đọc kết quả: phản ứng (+) d−ơng tính hồng cầu lắng xuông đáy, nh− vậy,virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn t−ơng ứng với nhau.
Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn: ng−ỡng bảo hộ hiệu giá (HI) = 4 log2.
kháng thể cao hiệu giá (HI) > 4 log2.
không đ−ợc bảo hộ hiệu giá (HI) < 4 log2.
2.3.2.6.Ph−ơng pháp phân lậpvirus cúm trên trứng gà có phôi
* Chuẩn bị bệnh phẩm tr−ớc khi phân lập:
- Dịch ngoáy ổ nhớp:
+Lắc mạnh ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc vortexmixer. + Bỏ tăm bông vào ống dịch ngoáy.
+ Bổ sung 1/10 l−ợng kháng sinh đậm đặc, lắc đều.
+Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phútở nhiệt độ phòng.
Mẫu đv sẵn sàng để tiêm truyền.
+ Bổ sung1/10 l−ợng kháng sinh, chuyển sang ống ly tâm, ly tâm với tốc độ2.000vòng/phút trong 10 phút.
+Thu dịch nổi.
* Tiến hành phân lập:
- Chọn trứng có phôi9 - 10ngày tuổi khoẻ mạnh, 3trứng/bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn70% và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi.
- Dùng seringe 1 ml hút dịch bệnh phẩm (đv xử lý ở trên) tiêm vào xoang niệu mô với l−ợng0,2 ml/trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán.
- ấp trứng tiếp 2 - 3ngày ở nhiệt độ 37oC.
- Theo dõi sau khi tiêmsoi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết đ−ợc cất vào tủ lạnh 4oCđể kiểm tra.
Phôi trứng chết hoặc sống đ−ợc cất vào tủ lạnh 4oC qua đêm hoặc ít nhất4 giờ tr−ớc khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dùng kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên.
- Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm (thu hoạch riêng trứng sống và chết).
- Mẫu đv phân lập đ−ợc kiểm tra bằng phản ứng HA.
2.3.2.7. Phản ứng Real time R T- PCR
* Nguyên liệu
-N−ớc cất vô trùng (Rnase- free).
-RNAđối chứng d−ơng tínhM, H5 và H7.
- Cồn tuyệt đối. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Isopropanol 99%tinh khiết. - Chloroform, 99%tinh khiết.
- Trizol LS reagent (Invitrogen, cat #10296 - 010hoặc10296 - 028). - Kít chiết tách Qiagen Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).
- Kit RT-PCR 1 bước Qiagen (cat # 210210 hoặc 210212) hoặc Superscript RT - PCR One-Step RT - PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat 10928 - 034 hoặc 10928 - 042, Invitrogen).
Bảng 2.1. Trình tự chuỗicủa mẫu giò vàPrimer cho RRT- PCR phát hiện cúm gia cầm
Đặc hiệu Trình tự chuỗi
M + 25*
5’ Primer 5’-AGA TGA gTC TTC TAA CCg Agg TCg- 3’
M + 64*
Mẫu dò 5’- FAM - TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA - TAMRA - 3’
M (cho bất
kỳ cúmA)
M - 124*
3’Primer 5’- TgC AAA AAC ATC TTC AAg TCT CTg - 3’
H7 + 1244*
5’ Primer 5’- ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg - 3’
H7 + 1281*
Mẫu dò a 5’- FAM - TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC - TAMRA - 3’
H7
(BắcMỹ)
H7 - 1342*
3’Primer 5’- TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg - 3’
H5 + 1456* 5’ Primer
5’- ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA - 3’
H5 + 1637* Mẫu dò
5’- FAM - TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCA - TAMRA - 3’
H5
H5 - 1685*
3’Primer 5’- AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC - 3’
- Rnase Inhibitor, 40 unit/àl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515).
- MgCl2, 25 àM (Promega, cat # A3511 hoặcA3513). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ĐệmTE pH 8.0, 1 X,(Promega # V6231 hoặc V6232).
- 14,3 Mβ -mercaptoethanol(β - ME) (Sigma M6250).
- Hạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RRT - PCR đv đ−ợc chuẩn bị
bởi Cepheidđể sử dụng cho các xét nghiệm M và H5. Mỗi hạt chất phản ứng đủ cho 4 phản ứng loại 25àl. Mỗi giọt chứa primer và mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, và đệm HEPES. Thêm vào đó giọt M gồm cả chất điều khiển trong (IC). Mục đích của IC là phát hiện 1 âm tính giả tạo ra từ các chất ức chế
không đặc hiệu của quá trình nhân gen.
- Chất điều khiển trong M là một ARN chuỗi đơn đv phiên mv dài 228 base.Nó chứa chuỗi bổ sung vớiprimertiếnM ở đầu 5’vàprimerlùi ở đầu3’ và 1 chuỗi bên trong để gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò đánh dấu
FAM để phát hiện gen M, và mẫu dò đánh dấuCal-Flour Red 610 cho IC.
- Hạt chất phản ứng H5 gồm có 2 primer tiến, 1 để phát hiện AIV H5 dòng Bắc Mỹ và 1 để phát hiện AIV H5dòng Âu - á chất phản ứng H5, 1mẫu dò H5 đánh dấuFAM phát hiện đ−ợc cả 2 dòng. Chất phản ứng đ−ợc chia vào các ống 0,5 àlcó thể sử dụng để hoàn nguyên. Chất phản ứng đ−ợc sử dụng với dNTP và enzyme của kít Qiagen RT-PCR onestep. Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 4oCtrong 6 tháng không cởi bỏ túinếu ch−a sử dụng.
* Các b−ớc tiến hành
Tr−ớc khi làmRT - PCR, đặt cácpipet, khay, đầu pipet,... vào buồng vô trùng sạch. T−ơng tự, đặt các dụng cụ làm mẫuvào buồng vô trùng khác. Bật đèn tử ngoại trong nhiều giờ hoặc qua đêm để giảm tạp nhiễmARN từ pipet và các dụng cụ khác.
- Chiết táchARN từ mẫu dịch ngoáy (ph−ơng phápQiagen RNeasy). + Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển l−ợng