NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.4.2 Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.2.1 Phương phỏp ủiều tra dịch tễ học
* Bảng sơ ủồ bố trớ lấy mẫu: để xỏc ủịnh tỷ lệ nhiễm bệnh cầu trựng tại ba huyện (Việt Yờn, Yờn Dũng, Lạng Giang) của tỉnh Bắc Giang. Căn cứ vào tỡnh hỡnh chăn nuụi và dịch bệnh chỳng tụi tiến hành bố trớ lấy mẫu trong mỗi huyện như sau:
Tỡnh hỡnh chăn nuụi: Những huyện chăn nuụi lợn nhiều
Dịch bệnh: Lợn con dưới 1 thỏng tuổi mắc bệnh tiờu chảy nhiều.
Trờn cơ sởủỏnh giỏ sơ bộ của từng huyện chỳng tụi bố trớ thớ nghiệm như sau:
Tờn huyện Tờn xó Tờn xúm Dự tớnh tổng số mẫu lấy trong mỗi xó Việt Tiến Gồm 6 xúm: 1, 2, 5,6,8,10. 55 ữ 70 Thương Lan Gồm 6 xúm: Bắc, Nam, Nguộn, GốcGạo,Thượng, Ngõn sơn. 60 ữ 80 Bớch Sơn Gồm 6 xúm: Vàng, Tự, đồn Lương, Xuõn tiến, đồng Lạc,Lửa Hồng 55 ữ 70 Minh đức
Gồm 6 xúm: Cầu Sim, Mỏ, Bói, trại, Ngõn đài,
Bảo đài 50 ữ 65 Trung Sơn Gồm 6 xúm: 2,4, 5,7, 8,10 55 ữ 70 Việt Yờn Võn Trung Gồm 6 xúm: 1,2,5,7,10,11 50 ữ 65 Tõn Mỹ Gồm 6 xúm: 2,3,5,6,7,10 55 ữ 70 Yờn Dũng Nội Gồm 6 xúm: 2, 5,6,7,9,8 50 ữ 65
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ37 Hoàng Trớ Yờn Gồm 6 xúm: Nam thành, Bắc Thành, đan Phượng, Quốc Khỏnh, Minh đức, Tõn Thịnh 60 ữ 80 Tõn An Gồm 6 xúm: Sơn Hựng, Thăng Long,
Phương Sơn, Hố Quýt, đầu Voi, Thịnh
đức 50 ữ 65 Phỳ Xuõn Gồm 6 xúm: Gũ Múc, Bắc Thành, đoài, đụng, Hồng Lạc, Hồng An. 60 ữ 80 đồng Việt Gồm 6 xúm: Xúm Bến Trại, đồng Lạc,
Minh Tõn, Xúm Giữa, Nỳi, đồng Xuõn. 55 ữ 70
Nghĩa Hưng Gồm 6 xúm: 1,2,5,7,10,9 55 ữ 70 Nghĩa Hũa Gồm 6 xúm: 3,4,6,7, 9,10 50 ữ 60 An Hà Gồm 6 xúm: An Hải, Thăng Long, Bỡnh
Gia, Hũa Bỡnh, Xương Giang, Trung Thành 50 ữ 60 Tõn Hưng Gồm 6 xúm: 2,4, 5,7, 8,1 55 ữ 65 Quang Thịnh Gồm 6 xúm: Quang Trung, Bắc Sơn, Kỳ
đài, Thịnh Hưng, Yờn Hưng, Cõy Thị. 50 ữ 60 Lạng
Giang
Thỏi đào Gồm 6 xúm: Thỏi Hà, Thỏi Thịnh, An
đào, Nghĩa Trung, Võn Sơn, Hồng Thỏi. 50 ữ 65
Dự tớnh tổng số mẫu lấy trong ba huyện 985 ữ 1250
* Qui ủịnh một số yếu tố liờn quan ủến dịch tễ của bệnh
Lứa tuổi của lợn: ủược chia làm 5 lứa tuổi, ủược thực hiện trong cả ba huyện với dự kiến số lượng mẫu như sau:
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ38
Tuổi của lợn (thỏng) Dự kiến số lượng mẫu lấy dưới 1 105 ữ 120 Trờn 1 ủến 2 317 ữ 400 Trờn 2 ủến 4 286 ữ 350 Trờn 4 ủến 6 107 ữ 200 Trờn 6 thỏng tuổi: Những lợn trờn 6 thỏng tuổi chủ yếu là những lợn nỏi sinh sản 170 ữ 180 Dự kiến tổng số mẫu lấy ở tất cả cỏc nhúm tuổi 985 ữ 1250
- đỏnh giỏ trạng thỏi phõn theo 3 mức:
Trạng thỏi phõn Dự kiến số
lượng mẫu lấy
+ Phõn bỡnh thường: Tạo thành khuụn, màu xanh ủen, mượt, khụng cú dịch nhày bao bọc, khụng cú mựi khỏc thường.
236 ữ 350
+ Phõn sệt: Khụng tạo thành khuụn mà ở dạng sền sệt, cú mựi thối ủụi khi cú lẫn dịch nhầy, màu xanh xỏm như nước xi măng.
361 ữ 450
+ Phõn lỏng: Phõn loóng, mựi thối khắm, cú màu sắc khụng bỡnh thường (màu vàng kem, vàng xỏm).
388 ữ 450
Dự kiến tổng số mẫu lấy ở 3 trạng thỏi phõn 985 ữ 1250
3.4.2.2 Phương phỏp thu nhận mẫu
* Mẫu phõn: Chỳng tụi lấy mẫu phõn vừa thải ra của lợn lai (YorkShire x Landrace)ở cỏc lứa tuổi (từ lợn sơ sinh ủến trờn 6 thỏng tuổi). để riờng mẫu phõn vào một tỳi nilon nhỏ, ở mỗi tỳi ủều phải ghi: Tuổi lợn, ủịa ủiểm, tớnh biệt, giống, tỡnh trạng vệ sinh, trạng thỏi phõn, phương thức chăn nuụi ngày thỏng lẫy mẫu và cỏc biểu hiện lõm sàng khỏc của lợn. Cỏc mẫu ủược xột nghiệm ngay trong ngày (nếu chưa kịp xột nghiệm sẽ ủược bảo quản ở nhiệt ủộ 20C Ờ 40C, khụng quỏ 3 ngày).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ39
* Mẫu phủ tạng: Chỳng tụi lấy mẫu ruột non, hạch màng treo ruột, ruột già, phổi, gan, thận của lợn bị bệnh và ghi: Tuổi lợn, ủịa ủiểm, tớnh biệt, giống, ngày thỏng lấy mẫu và cỏc biểu hiện lõm sàng của lợn. Mẫu tổ chức ngõm bảo quản trong formol 10% ủể làm tiờu bản vi thể.
* Mẫu mỏu: Chỳng tụi tiến hành lấy mỏu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn bị nhiễm bệnh vào buổi sỏng sớm trước khi cho lợn ăn và vận ủộng.
3.4.2.3 Phương phỏp xột nghiệm mẫu phõn
* để tỡm noón nang cầu trựng lợn chỳng tụi sử dụng phương phỏp sau ủõy: + Phương phỏp Darling: Cho phõn vào cốc thủy tinh, cho nước ló vào khuấy tan, lọc qua lưới lọc ủể loại bỏ cặn bó thụ. Ly tõm nước lọc với tốc ủộ 3000 vũng/3 phỳt tỷ trọng của noón nang sẽ nặng hơn tỷ trọng của nước, chỡm xuống dưới, chắt bỏ từ từ nước lớp trờn, giữ lại phần cặn sau ủú cho dung dịch nước muối bóo hũa, lắc ủều hoặc dựng ủũa thủy tinh khuấy ủều, rồi lại tiếp tục lại ly tõm lần nữa trong 3 phỳt tốc ủộ 3000 vũng, noón nang nhẹ hơn sẽ nổi lờn trờn. Sau ly tõm lần 2 dựng vũng vớt vớt lớp màng nổi bờn trờn, cho lờn phiến kớnh ủậy lamen, soi kớnh hiển vi tỡm noón nang cầu trựng.
- Phương phỏp ủỏnh giỏ cường ủộ nhiễm cầu trựng:
* Ph−ơng pháp xác định c−ờng độ nhiễm cầu trùng: Cường ủộ nhiễm cầu trựng ủược xỏc ủịnh bằng số lượng Oocyst/gam phõn (ủếm trờn buồng ủếm Mc. Masteur) và qui ủịnh cường ủộ nhiễm như sau.
≤ 4000 Oocyst /gam phõn: qui ủịnh cường ủộ nhiễm nhẹ (+)
> 4000 Ờ 8000 Oocyst /gam phõn: qui ủịnh cường ủộ nhiễm trung bỡnh (+ +) > 8000 - 12000 Oocyst /gam phõn: qui ủịnh cường ủộ nặng (+ + +) > 12000 Oocyst /gam phõn: qui ủịnh cường ủộ nhiễm rất nặng (+ + + +)
3.4.2.4 Phương phỏp xỏc ủịnh cỏc ủặc ủiểm bệnh lý
* Cỏc triệu chứng lõm sàng ủược xỏc ủịnh bằng phương phỏp khỏm lõm sàng thường quy.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ40
* Mổ khỏm lợn bị bệnh ủể kiểm tra bệnh tớch ủại thể
* Xỏc ủịnh bệnh tớch vi thể chỳng tụi lấy mẫu và nhuộm tiờu bản theo phương phỏp HE
+ Cỏc mẫu thu nhận: ruột non ( 3 ủoạn tỏ tràng, khụng tràng, hồi tràng), ruột già (3 ủoạn manh tràng, kết tràng, trực tràng), hạch màng treo ruột, phổi, gan, dạ dày, thận. Mẫu tổ chức ngõm bảo quản trong formol 10% ủể làm tiờu bản vi thể .
* Phương phỏp làm tiờu bản vi thểủược thực hiện theo quy trỡnh tẩm ủỳc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE).
- Cố ủịnh bệnh phẩm: Ngõm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chỳ ý bệnh phẩm phải ngập trong formol).
- Vựi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lượt cỏc bước sau:
+ Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bỡnh formol 10%, cắt thành cỏc miếng cú chiều dài, rộng khoảng 4-5mm cho vào khuụn ủỳc bằng nhựa. đem rửa dưới vũi nước chảy nhẹ trong 24h ủể rửa sạch formol.
+ Sau ủú ủưa mẫu vào hệ thống mỏy chuyển ủỳc mẫu tựủộng trong 18h. lấy mẫu ra và tiến hành ủỳc block.
Hệ thống mỏy chuyển ủỳc mẫu tự ủộng gồm 12 bỡnh Bỡnh Húa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1: 00 2 Cồn 600C 1: 00 3 Cồn 700C 1: 30 4 Cồn 800C 1: 30 5 Cồn 960C 1: 30 6 Cồn 1000C 1: 30 7 Cồn 1000C 1: 30 8 Cồn 1000C 1: 30 9 Xylen I 1: 30 10 Xylen II 1: 30 11 Parafin I 2: 00 12 Parafin II 2: 00
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ41
+ đỳc Block
đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chớnh giữa khuụn block ủổ nhanh parafin lỏng vào block.
đặt khuụn ủó ủỳc sang bàn lạnh của mỏy làm nguội block. để nguội từ từủến khi ủụng cứng và chắc là ủược.
- Cắt dỏn mảnh gồm:
+ Cắt mảnh: Cắt bằng mỏy microtom với ủộ mảnh cắt khoảng 3-5àm , sao cho mảnh cắt khụng rỏch, nỏt phần tổ chức.
+ Tói mảnh: Sau khi cắt ủược, dựng panh kẹp mảnh cắt ủặt vào nước lạnh sau ủú dựng phiến kớnh trong, sỏng, khụng xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 480C rồi lấy kớnh vớt mảnh cắt sao cho vị trớ mảnh cắt ở 1/3 phiến kớnh. Sau ủú ủể tủấm 370C ủến khi bệnh phẩm khụ là ủược.
- Nhuộm tiờu bản gồm cỏc bước:
+ Bước 1.Khử parafin: Cho tiờu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 3 -5 phỳt Xylen II: 3 -5 phỳt Xylen III: 3 -5 phỳt + Bước 2. Khử Xylen: Cho tiờu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ:
Cồn 1000C: 2 lần (mỗi lần 1 phỳt) Cồn 950C: 1 lần
Cồn 700C: 1 lần Cồn 500C: 1 lần
+ Bước 3. Khử cồn: Cho dưới vũi nước chảy 15 phỳt. + Bước 4. Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhõn)
Khi nhấc tiờu bản ra khỏi nước lau khụ xung quanh tiờu bản, nhỏ haematoxylin ngập tiờu bản. để trong khoảng hơn 5 phỳt sau ủú ủổ thuốc nhuộm ủi, rửa qua nước. đem lau sạch nước xung quanh tiờu bản và vẩy khụ ủi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiờu bản xanh tớm là ủược.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ42
+ Bước 5. Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiờu bản khoảng 5-10 phỳt tựy theo thực tế màu Eosin. Sau ủú rửa nước chảy 15 phỳt cho hết eosin thừa.
+ Bước 6. Cho tiờu bản qua hai lọ cồn 1000C mỗi lọ 1 phỳt.
+ Bước 7. Tẩy cồn, làm trong tiờu bản: Cho tiờu bản ủi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phỳt.
+ Bước 8. Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lờn lamen rồi gắn nhanh lờn tiờu bản khi vẫn cũn xylen trờn tiờu bản. Ấn nhẹủể dồn hết bọt khớ ra ngoài.
đỏnh giỏ kết quả
đem soi tiờu bản nhuộm dưới kớnh hiển vi quang học vật kớnh 10. Nếu thấy nhõn bắt màu xanh tớm, bào tương bắt màu ủỏ tươi, tiờu bản trong sỏng, khụng cú nước, khụng cú bọt khớ là ủược.
* Xỏc ủịnh cỏc chỉ tiờu sinh lý, sinh húa mỏu bằng mỏy tựủộng
3.4.2.1 Phương phỏp gõy bệnh thực nghiệm
* Nuôi Oocyst cầu trựng trở thành dạng gây nhiễm
Chỳng tụi tiến hành nuụi Oocyst cầu trựng trong hai mụi trường trong phõn ngoài ngoại cảnh và mụi trường Bichromate kali 2,5%.
+ Trong môi tr−ờng phân lợn ở ngoài ngoại cảnh
Lấy những mẫu phõn lợn mới thải ra của những lợn nhiễm cầu trựng nặng. Cho phõn vào ủĩa Pờtri và ghi ngày thỏng bắt ủầu theo dừi, ủể trong ủiều kiện nhiệt ủộ, ẩm ủộ, ỏnh sỏng tự nhiờn ở trong phũng thớ nghiệm. Mỗi ngày lấy một lượng phõn nhỏ ra xột nghiệm bằng phương phỏp Darling ủể kiểm tra hỡnh thỏi, màu sắc, sự biến ủổi của Oocyst ở ngoài ngoại cảnh. Từ ủú xỏc ủịnh ủược thời gian phỏt triển thành Sporocyst ở ngoài ngoại cảnh. (Sporocyst là những Oocyst ủó hỡnh thành 4 tỳi bào tử ủối với giống
Eimeria, trong mỗi tỳi bào tử chứa 2 thể bào tử; 2 tỳi bào tử ủối với giống
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệpẦẦ.. ẦẦẦ43
bệnh hay (Sporocyst). Sau ủú thu nhận Oocyst cú sức gõy bệnh bằng phương phỏp Darling ủể gõy bệnh thực nghiệm cho lợn.
+ Trong mụi trường Bichromate kali 2,5%
Cho Oocyst cầu trựng dó thu nhận vào lọ dung tớch 20 ml cú chứa dung dịch Bichromate kali 2,5%. Hàng ngày lắc nhẹ và lấy một vài giọt dung dịch
Bichromate kali 2,5% cú chứa Oocyst cầu trựng, soi kớnh hiển vi mụ tả sự biến ủổi hỡnh thỏi và cấu trỳc của Oocyst. Từ ủú xỏc ủịnh ủược thời gian phỏt triển của
Oocyst thành Sporocyst trong mụi trường Bichromate kali 2,5%. Sau ủú thu nhận
Oocyst cú sức gõy bệnh bằng phương phỏp Darling, trong quỏ trỡnh thu nhận
Oocyst cú sức gõy bệnh từ mụi trường Bichromate kali 2,5% chỳng tụi cho vào cốc nước sạch ủể rửa, sau ủú kiểm tra số lượng mầm bệnh ủịnh liều gõy bệnh. Nếu trong một 1ml canh trựng kiểm tra cú từ 5000 ữ 7000 noón nang là ủược.
* Thiết kế thớ nghiệm: Chỳng tụi chọn 3 lợn 18 ngày tuổi khỏe mạnh (Khụng cú biểu hiện lõm sàng, xột nghiệm phõn khụng cú cầu trựng, ăn uống, hoạt ủộng bỡnh thường). Mục ủớch: - Xỏc ủịnh những biểu hiện lõm sàng của lợn bệnh thớ nghiệm - Nhằm làm sỏng tỏ những biến ủổi về mỏu của lợn bệnh so với lợn mắc bệnh tự nhiờn từủú cú kết luận cụ thể. Cỏc bước tiến hành:
đối với nhúm lợn thớ nghiệm: cho lợn nuốt khoảng 100 Ờ 140 nghỡn noón nang cú sức gõy bệnh (tức 20 ml canh trựng canh trựng cú chứa noón nang cú sức gõy bệnh) hàng ngày theo dừi cỏc biểu hiện của lợn và sau 7 Ờ 8 ngày lấy phõn xột nghiệm tỡm cầu trựng.
Thời ủiểm lấy mỏu xột nghiệm: Chỳng tụi tiến hành lấy mỏu của lợn bệnh vào thời ủiểm khi lợn cú biểu hiện lõm sàng rừ nhất, xột nghiệm phõn thấy lợn thải noón nang nhiều nhất.