và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1. 1. Xác định tỷ lệ viêm tử cung ở đàn lợn nái
+ Tỷ lệ mắc bệnh chung.
+ Thực trạng bệnh viêm tử cung do các yếu tố khác nhau(lứa đẻ,thụ tinh nhân tạo,can thiệp khi đẻ…).
3.1.2. Mối quan hệ giữa bệnh viêm tử cung lợn mẹ và hội chứng tiêu chảy ở lợn con
3.1.3. Xác định sự thay đổi một số chỉ tiêu lâm sàng của lợn nái mắc bệnh viêm tử cung (nhiệt độ, hô hấp, tuần hoàn, màu sắc dịch viêm..) 3.1.4. Sự biến đổi về vi khuẩn học trong dịch viêm tử cung của lợn
+ Xác định thành phần và số l−ợng các loại vi khuẩn trong dịch đ−ờng sinh dục ở lợn nái sinh sản bình th−ờng và lợn nái bị mắc bệnh viêm tử cung. + Làm kháng sinh đồ xác định tính mẫn cảm với các loại vi khuẩn có trong dịch viêm tử cung.
3.1.5. Thử nghiệm điều trị bệnh viêm tử cung bằng các phác đồ khác nhau và theo dõi khả năng sinh sản sau khi sạch bệnh của từng phác đồ điều trị(tỷ lệ khỏi,tỷ lệ động dục…sau điều trị)
3.1.6.Thử nghiệm điều trị hội chứng tiêu chảy ở đàn lợn con bằng ph−ơng pháp kết hợp với điều trị bệnh viêm tử cung ở lợn mẹ .
3.1.7. Thử nghiệm phòng bệnh viêm tử cung bằng cách thụt dung dịch lugol 0.1% vào tử cung của lợn nái sau đẻ.
3.1.8. Xây dựng đ−ợc khuyến cáo qui trình phòng và trị bệnh viêm tử cung ở lợn nái sinh sản.
3.2. Đối t−ợng và nguyên liệu nghiên cứu
3.2.1. Đối t−ợng nghiên cứu
Đối t−ợng nghiên cứu của đề tài là:
- Đàn lợn nái ngoại đang trong giai đoạn sinh sản nuôi tại các trang trại thuộc huyện Từ Sơn thành phố Bắc Ninh
- Đàn lợn con đ−ợc sinh ra từ những lợn mẹ mắc bệnh viêm tử cung đang ở trong giai đoạn bú sữa.
3.2.2. Nguyên liệu nghiên cứu
3.2.2.1. Các môi tr−ờng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
* Các môi tr−ờng phổ thông chúng tôi tự chế tạo tại phòng thí nghiệm
- Môi tr−ờng n−ớc thịt: dùng để nuôi cấy mẫu xét nghiệm ngay từ đầu. - Môi tr−ờng thạch th−ờng: dùng để kiểm tra khuẩn lạc và làm kháng sinh đồ.
* Các môi tr−ờng chuyên dụng dùng trong phân lập và giám định vi khuẩn
- Môi tr−ờng Sapman: dùng để phân lập và xác định độc lực của cầu khuẩn.
- Môi tr−ờng Brilliant Green agar: dùng để phân lập vi khuần E.coli và
Salmonella.
- Môi tr−ờng Edwards medium: dùng để phân lập vi khuẩn
Streptococcus.
3.2.2.2. Giấy tẩm kháng sinh
- Các mảnh giấy chuẩn đ0 đ−ợc tẩm kháng sinh theo đúng tiêu chuẩn Quốc tế do h0ng Oxoid (Anh) sản xuất.
- Các thuốc kháng sinh dùng để tẩm đều đạt tiêu chuẩn d−ợc điển Việt Nam 1994 do phòng quản lý thuốc thú y - Cục thú y Trung −ơng cung cấp.
- Với mỗi loại giấy tẩm kháng sinh lại có mức độ mẫn cảm và hàm l−ợng kháng sinh trong từng mảnh giấy khác nhau trong bảng d−ới đây: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Kháng sinh chuẩn với tính mẫn cảm của vi khuẩn
Tên thuốc Kháng sinh trong 1 mảnh giấy (àg) Kháng thuốc Φ (mm) Mẫn cảm TB Φ (mm) Rất mẫn cảm Φ (mm) Ciprofloxacin 15 ≤ 13 15 - 20 ≥ 23 Norfloxacin 10 ≤ 12 13 - 17 ≥ 17 Amoxycillin 20 ≤ 13 14 - 16 ≥ 17 Nitrofuran 300 ≤ 14 15 - 16 ≥ 17 Gentamicin 10 ≤ 12 13 - 14 ≥ 15 Oxacillin 1 ≤ 10 11 - 12 ≥ 13 Ampicillin 10 ≤ 11 12 - 13 ≥ 14 Erythromycin 15 ≤ 13 13 - 17 ≥ 18 Polymycin B 300IU ≤ 08 09 - 11 ≥ 12 Chloramphenicol 30 ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 Sulphamethoxazole Trimethoprin 27,75/1,25 ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 Ofloxacin 5 ≤ 11 11 - 13 ≥ 13
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
+ Xác định tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm tử cung bằng ph−ơng pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp công nhân làm tại trại, kết hợp với theo dõi trực tiếp.
+ Xác định phác đồ điều trị bệnh hữu hiệu qua theo dõi khả năng sinh sản của những lợn nái sau khi đ−ợc điều trị lành bệnh.
3.3.1. Lấy mẫu dịch tử cung của lợn bình th−ờng sau đẻ và lợn đang bị viêm tử cung
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn để xét nghiệm
- Lấy mẫu dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bình th−ờng sau đẻ 12 -24 giờ và lợn bị viêm tử cung, âm đạo. Phân lập giám định thành phần, số l−ợng vi khuẩn trên các môi tr−ờng chuyên dụng theo các ph−ơng pháp vi sinh vật th−ờng quy.
- Làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp của Kirby - Bauer (1996) - Giấy tẩm kháng sinh do h0ng Oxoid (Anh) sản xuất.
- Đánh giá kết quả dựa theo tiêu chuẩn quốc tế 1996 (antibiotic susceptibility testing 1996)
+ Với lợn sau đẻ: dùng mỏ vịt (đ0 đ−ợc sát trùng) để mở âm đạo sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm đ0 đ−ợc vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3- 5 ml.
+ Với lợn bị viêm, dùng mỏ vịt (đ0 đ−ợc sát trùng) mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm đ0 đ−ợc vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5 ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu
- Các mẫu dịch thí nghiệm sau khi lấy đựơc giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ
theo ph−ơng pháp nghiên cứu vi khuẩn học.
- Để có thể đếm đ−ợc số khuẩn lạc trên môi tr−ờng thạch th−ờng, tuỳ theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha lo0ng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha lo0ng khác nhau, chúng tôi đ0 xác định đựơc độ pha lo0ng thích hợp với các bệnh phẩm nh− sau:
+ Dịch tử cung lợn sau đẻ là: 10-4
+ Dịch tử cung lợn bệnh lý là: 10-7
- Đếm tổng số khuẩn lạc trên 1 đĩa thạch và quy đổi trong 1ml dịch tử cung. - Sau khi pha lo0ng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch đĩa. Mỗi mẫu xét nghiệm đ−ợc đ−a vào 2 đĩa thạch th−ờng và đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch đ−ợc cấy 0,1 ml dịch. Các đĩa thạch đựơc đánh số rõ ràng. Tất
cả đ−ợc bồi d−ỡng trong tủ ấm 37oC/24 giờ. Để có kết quả chính xác, cần
thống nhất nhiệt độ và thời gian nuôi cấy. Sau đó đếm số khuẩn lạc có trong các đĩa ở môi tr−ờng thạch th−ờng và thạch chuyên dụng. Đếm tổng số khuẩn lạc có trong 3 đĩa thạch tính ra số khuẩn lạc trung bình của mỗi đĩa. Số vi khuẩn có trong 1 ml dịch mẫu đ−ợc tính theo công thức:
X= 10.A.N
Trong đó: X: số khuẩn lạc trong 1ml dịch.
A: số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa. N: độ pha lo0ng.
- Để đếm đ−ợc tổng số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, tr−ớc tiên chúng tôi dùng môi tr−ờng thạch th−ờng để đếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một đĩa thạch ở độ pha lo0ng thích hợp. Đồng thời, chúng tôi còn sử dụng các môi tr−ờng chuyên dụng sau để đếm các loại vi khuẩn có mặt chủ yếu ở tử cung lợn khi bị viêm:
+ Môi tr−ờng Sapman dùng đếm vi khuẩn Staphylococcus.
+ Môi tr−ờng Edwards medium dùng đếm vi khuẩn Streptococcus.
+ Môi tr−ờng Brilliant green-agar dùng đếm vi khuẩn E.coli và
Salmonella
- Tổng số khuẩn lạc có trong 2 đĩa thạch trên phải nhỏ hơn hay bằng tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch th−ờng ở cùng một nồng độ pha lo0ng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2. Ph−ơng pháp xác định số loại và số l−ợng vi khuẩn
- Các đĩa thạch th−ờng sau khi đ0 ria cấy vi khuẩn, bồi d−ỡng trong tủ
ấm 37oC/24 giờ, lấy ra quan sát hình thái, kích th−ớc và dạng khuẩn lạc. Từ đó
sơ bộ định loại vi khuẩn.
- Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi tr−ờng cố thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kích th−ớc, hình dáng và màu sắc riêng biệt nh−:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng có
màu vàng rơm (nếu là Staphylococcus aureus).
+ Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, mầu hơi xám, bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể có khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể có dạng R, khuẩn lạc tròn, ớt, không trong suốt, mầu tro, trắng nhạt, hơi lồi.
- Sau khi xác định đựơc các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phiết kính, nhuộm gram để xem hình thái, tính chất bắt màu và cấu trúc đặc biệt của vi khuẩn nh−:
+ Staphylococcus: bắt màu (Gr+), hình cầu, tụ lại hình chùm nho. + Streptococcus: bắt màu (Gr+), có hình cầu hoặc hình trứng, đứng
riêng lẻ hoặc chuỗi.
+ E.coli: bắt màu (Gr-), là trực khuẩn hình gậy, ngắn; bắt mầu thẫm ở hai đầu.
+ Salmonella: bắt mầu (Gr-), là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn. - Khuẩn lạc đ0 đ−ợc tách thuần khiết, cấy vào các môi tr−ờng phân lập, để xác định tính chất mọc của chúng trong các môi tr−ờng này.
+ Môi tr−ờng Sapman: Staphylococcus khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ
cầu gây bệnh thì môi tr−ờng biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi tr−ờng giữ nguyên màu đỏ.
+ Môi tr−ờng Edwasds: Streptococcus khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi lồi, ớt,
mịn, rìa gọn.
+ Môi tr−ờng Brilliant: E.coli làm môi tr−ờng biến màu vàng chanh.
Salmonella làm môi tr−ờng có màu đỏ.
- Cuối cùng cấy chuyển thạch máu giữ giống để giám định tiếp nếu có thể. Toàn bộ quy trình thí nghiệm, xác định số l−ợng, số loại, phân lập vi khuẩn có trong dịch tử cung bò bình th−ờng, bệnh lý rồi đ−ợc kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh và thuốc hoá học trị liệu từ đó đ−a ra phác đồ điều trị.
3.3.3. Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc từ dịch tử cung lợn với các thuốc hoá học trị liệu bằng ph−ơng pháp làm kháng sinh đồ
- Tiến hành làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch của Kirby – Bauer.
- Ph−ơng pháp chỉ dùng canh trùng nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC trong 24
giờ, ria cấy trên mặt thạch. Để đĩa thạch từ 3 đến 5 phút cho khô, nh−ng không quá 25 phút. Sau đó dùng panh vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh
tiếp xúc đều với mặt thạch. Các mảnh giấy kháng sinh đặt cách nhau không d- −ới 24 mm.
- Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch đ−ợc khoảng 15 phút, đặt đĩa
thạch vào tủ ấm 37oC, sau 16 - 18 giờ lấy ra đọc kết quả. Kết quả đ−ợc đọc
bằng cách dùng th−ớc mm để đo đ−ờng kính của vòng vô khuẩn, đo phía sau mặt đĩa thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đ−ờng kính của vòng vô khuẩn đựơc tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kết quả kháng sinh đồ chỉ đ−ợc ứng dụng điều trị với vi khuẩn còn mẫn cảm với thuốc kháng sinh, còn khi vi khuẩn đ0 kháng thuốc tức vòng vô khuẩn d−ới mức diệt khuẩn thì không đ−ợc dùng.
- Khi vi khuẩn ở mức rất mẫn cảm chúng ta sử dụng thuốc ở liều điều trị trung bình. Khi vi khuẩn mẫn cảm ở mức trung bình thì thuốc điều trị đ0 chọn phải dùng ở liều cao hơn, hoặc bơm thẳng vào vị trí đang bị bệnh trong cơ thể (bơm vào tử cung).
- Vi khuẩn kháng thuốc, tuyệt đối không dùng thuốc đ0 bị kháng để điều trị bệnh.
3.3.4. Ph−ơng pháp xác định các đại l−ợng
Tổng số con mắc bệnh
+ Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) = x 100
Tổng số con theo dõi Tổng số con mắc lặp lại
+ Tỷ lệ mắc lặp lại (%) = x 100
Tổng số con phối lần đầu có chửa
+ Tỷ lệ lợn phối lần đầu có chửa (%) = x 100
Tổng số con khỏi bệnh
3.3.5. Ph−ơng pháp xác định các chỉ tiêu lâm sàng
Để xác định một số chỉ tiêu lâm sàng chính nh−: thân nhiệt, màu sắc dịch viêm, mức độ thu nhận thức ăn chúng tôi đ0 sử dụng những ph−ơng pháp th−ờng quy đếm nhiều lần hoặc quan sát vào một thời điểm quy định và lấy số bình quân.
+ Thân nhiệt: dùng nhiệt kế thuỷ ngân để đo thân nhiệt, một ngày đêm đo 2 lần:
Sáng: 7 - 9h Chiều: 16 - 18h
+ Màu sắc dịch viêm: theo dõi, quan sát bằng mắt th−ờng và ghi chép. + Bỏ ăn: Kiểm tra l−ợng thu nhận thức ăn và ghi chép.
3.4. Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu đều đ−ợc theo dõi, ghi chép và xử lý bằng ph−ơng pháp thống kê sinh vật học thông qua phần mềm Excel trên máy vi tính.