và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1 Nội dung
3.1.1 Khảo sát thực trạng hoạt động giết mổ trên địa bàn huyện Quốc Oai. 3.1.2 Kiểm tra một số vi khuẩn trong n−ớc sử dụng cho giết mổ trên địa bàn
huyện Quốc Oai: - Tổng số VKHK - E.coli
3.1.3 Kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn trong thịt lợn tại một số cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Quốc Oai dựa vào một số chỉ tiêu nh− sau:
- Tổng số VKHK - E.coli
- Salmonella - Sta.aureus
* Thí nghiệm đ−ợc thực hiện tại:
Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, khoa Thú y - Tr−ờng Đại
học Nông nghiệp I, Hà Nội.
3.2 Nguyên liệu
3.2.1 Mẫu xét nghiệm
- Mẫu n−ớc sử dụng cho các cơ sở giết mổ.
3.2.2 Các loại môi tr−ờng và thuốc thử sử dụng
- Môi tr−ờng n−ớc thịt, thạch máu, thạch th−ờng.
- Môi tr−ờng thạch: Macconkey; Endo; Brilliant green agar; Simon - Citrat; SS; Sapman…
- Môi tr−ờng tăng sinh: BHI, Muler Kaffman; Selenit; Rappaport... - Các loại thuốc thử: β- Galactosida, dung dịch Baritt, dung dịch Kowacs, dung dịch n−ớc pepton glucose.
3.2.3 Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, trọng l−ợng 18 - 20 g/con. 3.2.4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất dùng trong thí nghiệm
Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thuỷ, cân, buồng cấy vô trùng, máy ly tâm, kính hiển vi có vật kính dầu, cối chày sứ cỡ trung bình, ống pancol. Các loại thuốc nhuộm: Giemsa, Lugol, cồn - axeton, Fucshin ,… n−ớc sinh lý, đèn cồn, que cấy, hộp lồng, khay men, dao mổ, kéo cắt...
3.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Ph−ơng pháp điều tra
Sử dụng ph−ơng pháp thống kê chuyên môn, lập phiếu điều tra: thu thập số liệu điều ra thực trạng hoạt động cơ sở giết mổ.
3.3.2. Ph−ơng pháp xét nghiệm
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng các kỹ thuật xét nghiệm, phân lập và giám định vi khuẩn theo tiêu chuẩn qui định của Việt Nam. Đồng thời tham khảo của Newzealand, 1991 [61]; FAO, 1992 [44]; Viện Y học Lao động và Vệ sinh môi tr−ờng Bộ Y tế, Hà Nội, 1993 [43].
* Kiểm tra vi sinh vật có trong nguồn n−ớc sử dụng cho giết mổ
N−ớc dùng tại các điểm giết mổ bảo quản và phân tích theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5995 – 1995 và TCVN 6000 – 1995 (ISO 5667 – 5 và ISO 5667 – 11:1992).
- Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí + Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Dùng chai nút mài 500ml đ4 đ−ợc hấp, sấy tiệt trùng. Lấy mẫu n−ớc trong bể chứa hay đầu vòi n−ớc sử dụng, thao tác lấy mẫu phải đảm bảo vô trùng. Sau đó chuyển mẫu về phòng thí nghiệm phân tích.
+ Tiến hành phân tích
Sử dụng ph−ơng pháp rót thạch để xác định vi khuẩn. Mẫu n−ớc pha lo4ng ở các đậm độ khác nhau: 10- 1, 10- 2, 10- 3 ,… mỗi đậm độ cấy vào hai đĩa petri. Lấy 1ml n−ớc ở từng đậm độ pha lo4ng khác nhau cho vào giữa đĩa petri, rót vào mỗi đĩa 12 - 15ml môi tr−ờng thạch 46oC, trộn đều thạch với n−ớc pha lo4ng bằng cách lắc đi lắc lại 2 - 3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên và úp lại, đem bồi d−ỡng trong tủ ấm 37oC/24h.
Đọc kết quả và tính toán theo công thức:
A + 10B + 100C + 1000D N (vk/1ml) =
n
Trong đó: N: số l−ợng vi khuẩn trong 1ml n−ớc
A: số khuẩn lạc trong 1ml trạng thái ban đầu không pha B: số khuẩn lạc trong 1ml ở độ pha lo4ng 10- 1
C: số khuẩn lạc trong 1ml ở độ pha lo4ng 10- 2
D: số khuẩn lạc trong 1ml ở độ pha lo4ng 10- 3
- Ph−ơng pháp xác định vi khuẩn E.coli
Mẫu n−ớc kiểm tra pha lo4ng với các đậm độ: 10- 1, 10- 2, 10- 3,... Mỗi mẫu phải nuôi cấy ít nhất ba đậm độ liên tiếp.
+ B−ớc 1: N−ớc không pha (n−ớc nguyên) đ−ợc cấy vào 3 ống môi tr−ờng CLP 1,5% (canh thang Lactose). Với đậm độ pha lo4ng 10-1,10-2,10- 3..., mỗi đậm độ nuôi cấy trong 3 ống canh thang CLP 0,5%.
Mỗi ống canh thang CLP 1,5% cho 1ml n−ớc nguyên
Mỗi ống canh thang CLP 0,5% cho 1ml n−ớc pha lo4ng 10- 1, 10- 2, 10- 3
Để tủ ấm 42oC/24 - 48h đọc kết quả.
Đọc các ống d−ơng tính: môi tr−ờng chuyển từ màu tím sang vàng và có sinh hơi (làm nổi ống Durham), tra bảng MPN (Most probale number) tính kết quả.
+ B−ớc 2:
+/ Từ những ống d−ơng tính ở trên dùng que cấy vô trùng lấy một vòng canh trùng ria cấy trên thạch Endo hoặc môi tr−ờng MacConkey để tủ ấm 37oC/24h đọc kết quả.
+/ Trên môi tr−ờng MacConkey: khuẩn lạc E.coli có dạng S bờ đều bóng, màu đỏ. Từ những khuẩn lạc nghi E.coli dùng que cấy vô trùng cấy vào các môi tr−ờng sau:
Ure - Indol để kiểm tra tính chất sinh ánh kim, Indol (+) Clark - Lubs để kiểm tra: Phản ứng đỏ Methyl: MR(+)
Phản ứng Voges - Proskauer: V(-) Simon - Citrat: C(-)
E.coli cho phép kiểm nghiệm IMVIC (+ ,+ ,- ,-) tra bảng MPN để xác định tổng số E.coli trong 1000ml n−ớc (Coliindex).
* Xác định mức độ nhiễm khuẩn đối với thịt
- Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt (TCVN
5667 : 1992) [36].
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa hoặc nuôi cấy láng, đếm khuẩn lạc trên môi tr−ờng thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37oC/24 - 48h. Số l−ợng vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu đ−ợc tính theo số khuẩn lạc đếm đ−ợc từ các đĩa thạch nuôi cấy theo các đậm độ pha lo4ng khác nhau.
+ Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu (theo TCVN 4833 - 1:2002 và TCVN 4833 - 2:2002) [35].
+/ L−ợng mẫu pha lo4ng không ít hơn 25g. + Môi tr−ờng và thuốc thử
+/ Dung dịch pha lo4ng: n−ớc sinh lý
+/ Môi tr−ờng thạch đổ đĩa: thạch th−ờng Glucose + Các b−ớc tiến hành
+/ Pha lo4ng mẫu: Cân 25g thịt (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền tr−ớc trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác chứa 225ml n−ớc sinh lý, đem ly tâm trộn đều ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 3 phút, đ−ợc độ pha lo4ng ban đầu là 10- 1. Lắc đều mẫu thực phẩm và tiếp tục pha lo4ng cho tới nồng độ không còn khả năng d−ơng tính, tuỳ theo mẫu sạch hay bẩn mà pha lo4ng tới 10- 2, 10- 3, ...
+/ Đổ đĩa: Với mỗi mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng.
Chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp cấy láng trên thạch. Các đĩa thạch đ4 chuẩn bị tr−ớc (rót 12 - 15ml thạch vào hộp lồng, để nguội). Dùng bơm tiêm hút 0,1ml sản phẩm pha lo4ng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa
thạch, dùng que gạt thuỷ tinh láng đều cho tới khi mẫu đ−ợc phân bố đều trên mặt thạch.
+/ ủ ấm: úp các đĩa thạch và để tủ ấm ở nhiệt độ 37oC/24 - 48h. Sau 24h tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên các đĩa thạch. Sau 48h đọc kết quả chính thức.
+ Tính kết quả
Chọn tất cả các đĩa có từ 15 - 300 khuẩn lạc, sự phân bố của khuẩn lạc trên các đĩa thạch phải hợp lý. Độ pha lo4ng càng cao số khuẩn lạc càng thấp. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành các b−ớc nuôi cấy lại. Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g mẫu đ−ợc tính theo công thức sau:
ΣC N =
(n1+ 0,1n2).d
Trong đó: C: số khuẩn lạc đếm đ−ợc trên các đĩa đ4 chọn
n1, n2: số đĩa ở hai đậm độ pha lo4ng liên tiếp đ4 chọn thứ 1và 2 d: đậm độ pha lo4ng thấp hơn
N: Số khuẩn lạc trong 1g mẫu kiểm tra.
N biểu hiện kết quả d−ới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,0 với 10n (n là số mũ thích hợp của 10)
- Ph−ơng pháp phát hiện và tính số l−ợng E.coli có trong 1g thịt
Ph−ơng pháp phát hiện và đếm số E.coli trong 1g hoặc 100 cm2 thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho ng−ời và gia súc (TCVN 5155 - 1990) [38].
+ Nguyên tắc: căn cứ vào đặc tính sinh hoá để xác định vi khuẩn. Pha lo4ng mẫu thử ở các đậm độ khác nhau ria cấy trên môi tr−ờng chọn lọc để đếm và tính số vi khuẩn.
+ Lấy mẫu: Theo TCVN 4833 – 2002 [35]. + Môi tr−ờng và thuốc thử:
+/ Môi tr−ờng n−ớc thịt +/ Môi tr−ờng thạch th−ờng +/ Môi tr−ờng thạch Macconkey
+/ Môi tr−ờng n−ớc pepton glucose (để thử phản ứng đỏ Methyl và Voges - proskauer)
+/ Thuốc thử Indol (dung dịch Kowacs) +/ Thuốc thử đỏ Methyl (M.R)
+/ Thuốc thử Voges - Proskauer (dung dịch Baritt) + Cách tiến hành
+/ Lấy mẫu, đồng nhất và pha lo4ng mẫu:
Cân 100g - 225g thịt (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền tr−ớc trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác vô trùng, bổ sung 9 phần dung dịch n−ớc thịt pepton, trộn đều trong máy ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút (10- 1). Sau đó tiếp tục pha lo4ng tới đậm độ không còn khả năng d−ơng tính 10- 2, 10- 3, 10- 4.. +/ Nuôi cấy, phân lập và giám định: Với mỗi mẫu nuôi cấy ít nhất ở 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch Macconkey. Lấy 0,1ml dung dịch pha lo4ng ở mỗi đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch. Dùng trang gạt thuỷ tinh dàn đều trên mặt thạch.
Khuẩn lạc E.coli to, đục, mặt khô, màu đỏ.
Căn cứ vào hình dạng, màu sắc khuẩn lạc đếm, chọn 5 khuẩn lạc điển hình giám định tiếp tính chất sinh hoá bằng các phản ứng IMVIC. Nếu là E.coli:
Chú ý: E.coli không điển hình (atypic) có phản ứng (-) màu vàng nhạt. +/ Phản ứng đỏ Methyl (Methyl red): cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng n−ớc pepton glucose, ủ 37oC từ 2 - 4 ngày, nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl red vào, đọc kết quả. E.coli có phản ứng (+): màu đỏ (âm tính: màu vàng).
+/ Phản ứng Voges - prokauer: E.coli có phản ứng âm tính (V-) không màu hoặc màu vàng (d−ơng tính: có màu đỏ).
+/ Trên môi tr−ờng thạch Simon - Citrat: Ria cấy vi khuẩn trên mặt môi thạch nghiêng, ủ 37oC từ 1 - 3 ngày. E.coli không sinh tr−ởng phản ứng âm tính (C-).
Tính toán kết quả:
Kết quả đ−ợc tính toán theo công thức:
1 1
Xg = Số khuẩn lạc
đếm đ−ợc x Khối l−ợng mẫu nuôi cấy x Bội số pha lo4ng mẫu thử - Kỹ thuật phát hiện Salmonella trong thịt
Đ−ợc áp dụng theo TCVN 5153 - 1990, [37]. + Lấy mẫu: Theo TCVN 4833 - 2002
+ Môi tr−ờng và thuốc thử
+/ Môi tr−ờng Tetrationat (Muller - Kauffman) +/ Môi tr−ờng Salmonella - Shigella (SS) +/ Môi tr−ờng thạch Green Brilliant
+/ Môi tr−ờng n−ớc pepton (thử phản ứng sinh Indol) +/ Môi tr−ờng n−ớc pepton glucose (thử phản ứng VP) +/ Môi tr−ờng thạch ure (Christensen)
+/ Thuốc thử Indol (dung dịch Kowacs)
+/ Thuốc thử Voges - Prokauer (dung dịch Beuritt) + Các b−ớc tiến hành
+/ B−ớc 1: chuẩn bị mẫu, đồng nhất mẫu
Cân 25g thịt (bỏ mỡ, gân, bạc nhạc), nghiền nhỏ trong cối sứ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 225ml n−ớc đệm pepton BPW 2% (Buffer - Pepton - Water) trộn đều huyễn dịch mẫu, ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 2 phút. Để tủ ấm 37oC/24h.
+/ B−ớc 2: tăng sinh
Dùng pipet vô trùng hút 1ml canh trùng trên cho vào ống nghiệm có chứa 10ml môi tr−ờng Muller - Kauffman để vào tủ ấm 42oC. Ngoài ra, còn dùng các môi tr−ờng khác để tăng sinh Salmonella nh−: Selenit, Rappaport.
+/ B−ớc 3: phân lập trên các đĩa thạch chọn lọc
Dùng que cấy vô trùng cấy ria canh trùng từ ống tăng sinh sang 2 đĩa thạch SS và 2 đĩa thạch Green Brilliant (cấy th−a để tạo khuẩn lạc riêng rẽ).
Trên môi tr−ờng SS khuẩn lạc Salmonella có chấm đen ở giữa vì sinh H2S. Trên môi tr−ờng thạch Brilliant green khuẩn lạc Salmonella có màu hồng (không lên men đ−ờng Lactose và Saccaroza).
+/ B−ớc 4: kiểm tra tính chất sinh hoá
Từ khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella, cấy trên môi tr−ờng chọn lọc. Lấy ít nhất 3 khuẩn lạc cho một mẫu, cấy chuyển vào môi tr−ờng kiểm tra KIA theo ph−ơng pháp cấy chích sâu, để tủ ấm 37oC/24h. Kiểm tra những ống KIA có tính chất nh− sau:
K/AG có sinh hơi, sinh H2S hoặc không sinh H2S.
Những mẫu có phản ứng đặc tr−ng của vi khuẩn Salmonella trên môi tr−ờng KIA đ−ợc cấy kiểm tra và Urea, Indol, Lysin Decarboxylase. Tr−ớc khi tiến hành làm phản ứng huyết thanh học với các kháng huyết thanh
Salmonella chuẩn, cũng kiểm tra một số đặc tính sinh vật hoá học: Glucose
(+), Lactose (-), Mannitol (-), kiểm tra di động (+), Malonate (-), Dulatol. - Phát hiện và tính số l−ợng vi khuẩn Staphyloccus aureus có trong 1g thịt (Theo TCVN 5156 - 90) [39].
+ Lấy mẫu: theo TCVN 4833 - 2002 [35]. + Môi tr−ờng và thuốc thử
+/ Môi tr−ờng thạch th−ờng +/ Môi tr−ờng thạch Sapman +/ Môi tr−ờng tăng sinh BHI +/ Huyết t−ơng thỏ
+ Cách tiến hành
+/ Chuẩn bị mẫu, đồng nhất và pha lo4ng mẫu
Cân 100g - 225g thịt (không mỡ), nghiền nhuyễn trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác, bổ sung thêm 9 phần môi tr−ờng BHI (Brain Heart Infusion broth) trộn đều ở tốc độ 10.000 vòng/phút ta thu đ−ợc huyễn dịch có độ pha lo4ng ban đầu 10- 1. Tiếp tục pha lo4ng thành các đậm độ 10- 2, 10- 3, 10- 4... đến khi không còn d−ơng tính.
+/ Nuôi cấy, phân lập và giám định tính chất sinh hoá của Sta.aureus Mỗi mẫu cấy ít nhất ở 3 đậm độ liên tục, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch. Lấy 0,1ml dung dịch pha lo4ng ở mỗi đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch, dùng que gạt thuỷ tinh láng đều trên mặt thạch. Lật úp đĩa thạch, để tủ ấm 37oC/24h đọc kết quả.
Khuẩn lạc Sta.aureus tròn, lồi, bờ đều, bóng, có vòng trong suốt ở xung quanh, có màu vàng thẫm.
+/ Môi tr−ờng thạch Sapman: đây là môi tr−ờng đặc biệt để nuôi cấy và phân lập tụ cầu khuẩn. Thành phần môi tr−ờng gồm:
Thạch th−ờng: 1000ml NaCl : 75g Mannit : 10g Dung dịch Phenol đỏ 4%: 3 - 4ml
Khi cấy tụ cầu khuẩn vào môi tr−ờng thạch Sapman, nếu là tụ cầu khuẩn gây bệnh sẽ lên men đ−ờng Mannit làm pH thay đổi (pH = 6,8), môi tr−ờng Sapman lúc này trở nên vàng. Nếu tụ cầu khuẩn không gây bệnh sẽ không lên men đ−ờng Mannit, pH = 8,4 môi tr−ờng thạch Sapman có màu đỏ. Giám định lại kết quả bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra đặc tính làm đông huyết t−ơng của vi khuẩn Sta.aureus.
Lấy khuẩn lạc nghi ngờ là Sta.aureus, tăng sinh trong môi tr−ờng BHI để tủ ấm 37oC/24h. Lấy canh trùng cho vào huyết t−ơng thỏ theo tỷ lệ 1 : 4 (0,1ml canh trùng với 0,4 ml huyết t−ơng thỏ) để tủ ấm 37oC trong vòng 4 - 24h đọc kết quả.
Bảng 3.1. Đọc kết quả theo bảng Sperber và Tatini
Huyết t−ơng đông cứng sau 4 - 6h khó di động Huyết t−ơng đông chắc sau 6h dễ di động Huyết t−ơng đông thành cục nhỏ sau 24h Huyết t−ơng đông thành cục nhỏ sau không liên kết thành khối 4+ 3+ 2+ 1+ Xác định là Sta.aureus
Không đ−ợc xem là Sta.aureus Không đ−ợc xem là Sta.aureus Không đ−ợc xem là Sta.aureus
- Tính kết quả: t−ơng tự nh− cách tính số vi khuẩn E.coli có trong 1g thịt.
3.3.3 Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu đ−ợc trong các thí nghiệm đ−ợc xử lý theo ph−ơng pháp thống kê sinh vật học và sử dụng ch−ơng trình máy vi tính, phần mềm EXCEL.