- Phản ứng ELISA giỏn tiếp dựng ủể phỏt hiện khỏng thể
1.5.4. Chẩn ủ oỏn bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Về mặt truyền thống, việc chẩn ủoỏn, ủịnh type virus LMLM chủ yếu dựa vào sự khỏc biệt về tớnh khỏng nguyờn. Khỏng nguyờn là do cấu trỳc protein quyết ủịnh. Cấu trỳc khỏng nguyờn lại do thụng tin di truyền quyết ủịnh. Ngày nay, với tiến bộ của cụng nghệ sinh học phõn tử, người ta cú thể xỏc ủịnh trỡnh tự acid nucleic thay vỡ dựng cỏc phản ứng huyết thanh ủể xỏc ủịnh virus . Do vậy, cú một khỏi niệm mới ủể phõn biệt cỏc chủng virus LMLM bằng cỏch xỏc ủịnh mức ủộ khỏc nhau về acid nucleic giữa cỏc chủng virus LMLM . Phản ứng RT-PCR chớnh là một kỹ thuật mới dựa trờn khỏi niệm ủú ủược ứng dụng vào việc chẩn ủoỏn ủịnh type virus LMLM.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ủược Kary Mullis và cộng sự phỏt minh ra vào năm 1985. đõy là phương phỏp tạo dũng invitro cho phộp khuyếch ủại một vựng ADN (Deoxyribonucleic) ủặc hiệu từ một hệ gen phức tạp và khổng lồ mà khụng cần ủến việc tỏch và nhõn dũng. Cú thể sử dụng phản ứng PCR ủể làm
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ẦẦẦ28
tăng số lượng cỏc mảnh gen của virus LMLM cú trong bệnh phẩm cần chẩn ủoỏn, sau ủú so sỏnh trỡnh tự ủoạn ADN ủú với trỡnh tự ADN khỏc của virus LMLM ủó ủăng ký trong ngõn hàng dữ liệu gen.
Nguyờn lý của phản ứng PCR dựa vào ủặc ủiểm sao chộp ADN. ADN polymerase sử dụng cỏc ủoạn ADN mạch ủơn ủể tổng hợp nờn sợi bổ sung mới.
Tất cả cỏc ADN polymerase khi hoạt ủộng ủể tổng hợp nờn sợi ADN mới từ mạch khuụn thỡ ủều cần cú sự hiện diện của những cặp mồi (Primer) ủặc hiệu ủể khởi ủầu cho quỏ trỡnh tổng hợp.
Mồi là những ủoạn ADN ngắn (thường cú ủộ dài từ 6-30 nucleotid) cú khả năng bắt cặp bổ sung với một ủầu của ADN sợi khuụn, ADN polymarase sẽ kộo dài mồi ủể tạo thành sợi ADN mới.
Tuy nhiờn, ủể khuếch ủại một trỡnh tự ADN xỏc ủịnh thỡ ta phải cú ủược thụng tin về trỡnh tự gen của nú ủủ ủể tạo mồi chuyờn biệt. Một cặp mồi gồm cú một mồi xuụi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer). Trong phản ứng PCR thỡ cả hai sợi ADN ủều ủược dựng làm khuụn cho quỏ trỡnh tổng hợp nếu như mồi ủược cung cấp cho cả hai sợi. Cỏc ủoạn mồi sẽ bắt cặp với hai ủầu của ủoạn ADN cần nhõn lờn sao cho sự tổng hợp ADN mới ủược bắt ủầu tại mỗi ủoạn mồi và kộo dài về phớa ủoạn mồi nằm trờn sợi bổ trợ với nú. Như vậy, sau mỗi chu kỳ của phản ứng thỡ số ủoạn sao ADN cần nhõn lờn ủược tăng lờn gấp ủụi và ủiểm khởi ủầu cho mồi bắt cặp lại xuất hiện trờn mỗi sợi ADN mới ủược tổng hợp. Kết quả cuối cựng của phản ứng PCR sau n chu kỳ ủược tớnh theo lý thuyết là 2n bản sao của phõn tử ADN mạch kộp.
Như ủó trỡnh bày ở trờn, phản ứng PCR chỉ cú khả năng khuyếch ủại ADN do ủú với những trường hợp mà thụng tin di truyền là ARN như virus LMLM thỡ cần cú một quỏ trỡnh chuyển từ ARN thành ADN trước khi diễn ra phản ứng PCR. đú là phản ứng sao chộp ngược-Reverse Transciption (RT)