Phương pháp thu thập mẫu
Tiến hành thu thập mẫu bệnh ở các ñịa ñiểm ñiều tra, ghi nhận, thu thập tất cả các triệu chứng liên quan ñến bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây. Các mẫu bệnh thu thập ñược giữ trong túi giấy báo hoặc túi xi măng, có ghi rõ dạng triệu chứng, bộ phận bị bệnh, nguồn cây giống, tuổi cây, ñiều kiện ñất ñai, tuổi cây, ñịa phương thu thập, ngày ñiều tra. Sau khi thu thập mẫu ñược mang về phòng thí nghiệm ñể phân lập, giám ñịnh ngay hoặc ñược bảo quản trong tủ lạnh.
Phương pháp xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 44
* Quan sát trực tiếp vi sinh vật gây bệnh dưới kính hiển vi. * Phân lập ký sinh gây bệnh trực tiếp từ mẫu cây bệnh.
− Cắt mô bệnh thành những miếng có kích thước 1x1cm. Miếng cắt phải có cả mô bệnh và mô khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 70o trong 15 - 20 giây, sau ñó rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
− Thấm khô miếng cắt bằng giấy thấm vô trùng, dùng dao ñã khử trùng cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 5x5mm.
− ðặt các mảnh mô cây vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA). − Khi nấm ñã phát triển dài ra, cách mô bệnh 1 – 2 cm, lấy phần ñầu sợi
nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp như PDA, CMA, Czapeck, SPA.
− Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật, quan sát các vi sinh vật gây bệnh dưới kính hiển vi.
− Xác ñịnh tên nấm gây bệnh theo tài liệu của nước ngoài.
Phương pháp chẩn ñoán bệnh vàng lá greening bằng kỹ thuật PCR của Hong Ji Su gồm 5 bước
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và các hoá chất cần thiết
Mẫu sau khi thu thập ñược rửa dưới vòi nước nhằm làm sạch các vết bẩn và các hoạt chất sau khi phun thuốc trừ sâu, bệnh hại ñể làm tăng khả năng phản ứng PCR.
Bước 2: Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số từ lá, vỏ cành
- Thu thập mẫu và tách lấy gân lá và vỏ cành. Cân 0,5 gam mẫu, nghiền với 3ml dung dịch chiết và 0,3ml Sakosyl 10%. Lấy 1,5ml dịch nghiền vào tuýp eppendoft 1.6ml giữ ấm trong 55oC từ 1 ñến 2 giờ ñồng hồ.
- Ly tâm dung dịch chiết ñã ủ ấm 55oC ở tốc ñộ 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 0,8ml dung dịch phía trên cho vào eppendoft khác, thêm vào 100 µl dung dịch 5M NaCl và 100 µl CTAB 0.7M có tác dụng loại bỏ cacbamat
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 45
và làm mỏng các màng tế bào, tạo ñiều kiện tốt cho việc thu ADN, ñặt ở 650C trong 10 phút.
- Thêm vào ñó 0,6ml Chloroform/Isoamyl alcol (24:1) lắc mạnh, ly tâm 11.000vòng/phút trong 5 phút.
- Chuyển 0,8ml dung dịch phía trên sang một ống eppendoft khác và thêm 0,6ml Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc mạnh cho ñến lúc dung dịch biến thành màu sữa rồi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Lấy 0,6ml dung dịch phía trên cho vào eppendoft khác rồi thêm 360µl Isopropanol lắc nhẹ, có thể giữ ở nhiệt ñộ -20oC ít nhất 2 giờ hoặc qua ñêm.
- Ly tâm 15.000 vòng/phút trong 20 phút ñể thu ñược kết tủa. Rửa sạch viên kết tủa bằng cồn 70o rồi làm khô bằng máy hút chân không.
- Làm tan viên kết tủa bằng 100µl dung dịch TE buffer pH 8.0 và cất giữ ở nhiệt ñộ âm 20oC dùng làm ADN khuôn mẫu.
Bước 3: Nhân ADN bằng phương pháp PCR
- Các hoá chất dùng cho phân tích một mẫu bệnh greening bao gồm: Nước cất 2 lần ñã khử trùng 15 µl PCR buffer 2,5 µl MgCl2 25mM 2,0 µl dNTPs 2.5mM 2,0 µl Primer pairs 1,0 µl Taq polymeraza 0,5 µl
Tổng dung dịch pha PCR/mẫu 23 µl
Cho 22 µl dung dịch ñã pha ở trên vào tuýp PCR rồi thêm 3µl ADN khuôn mẫu ñã tinh sạch ở bước 1. Lập trình chạy PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 46
Bước 1: 92oC trong 1 phút có tác dụng làm biến tính ADN Bước 2: 60oC trong 1 phút có tác dụng làm tách sợi ADN Bước 3: 72oC trong 2 phút có tác dụng tổng hợp sợi ADN
Bước 4:Chạy ñiện di (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng ñộ agar ñể làm gen là 1,4%. Lấy 10µl sản phẩm PCR ñã hoàn thành cộng với 2µl dung dịch thuốc nhuộm, trộn ñều và nhỏ vào một giếng cho một mẫu.
Chạy ñiện di ở dòng ñiện 110 Vol, chạy theo chiều từ cực âm sang cực dương bằng dung dịch TBE pH8.0.
Bước 5:Phân tích kết quả dưới ñèn cực tím
Ngâm miếng gen ñã chạy ñiện di trong dung dịch Ethidium bromide nồng ñộ 3% ở khoảng thời gian 3 – 5 phút. Sau ñó ngâm, rửa ở trong nước cất 5 phút và kiểm tra kết quả.
Dựa vào thang chuẩn của dung dịch marker và mẫu ñối chứng ñể kiểm tra kết quả. Dùng ñoạn mồi của GS. Hong Ji Su, sản phẩm sẽ ở ñoạn 228bp.
Phương pháp chẩn ñoán nhanh bệnh greening trên ñồmg ruộng bằng kit Iodine.
− Thu thập những lá có triệu chứng bị vàng trên ñồng ruộng và bảo quản trong túi nilon.
− Dùng miếng giấy ráp 1 x 2cm chà lên bề mặt trên của lá vừa thu thập ñược.
− Miếng giấy ráp vừa thu ñược cho vào một túi nilon có chứa 1ml nước tinh khiết và sử dụng lượng nước ñó ñể rửa miếng giấy ráp vừa chà sát trên bề mặt lá.
− Cho 2 giọt dung dịch Iodine vào dung dịch vừa thu ñược, trộn ñều bằng tay. − Quan sát sự biến mầu của của dung dịch khi cho Iodine vào, mẫu bị
bệnh sẽ biểu hiện màu ñen hoặc nâu ñen, mẫu không bị bệnh greening sẽ giữ nguyên màu vàng của thịt lá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 47
Phương pháp giám ñịnh bệnh tristeza bằng ELISA Bước 1: Chuẩn bịñĩa phản ứng
Kháng thể ñơn dòng lai ñơn tính vi rút tristeza ñược pha loãng ở nồng ñộ thích hợp rồi nhỏ vào mỗi giếng của ñĩa ELISA 100µl. Sau ñó ủ trong tủ ñịnh ôn ở 37oC trong 2 tiếng.
Bước 2: Chuẩn bị dịch mẫu (Kháng nguyên)
Mẫu thu về ñược rửa sạch , tách gân rồi cân 0,5gram/mẫu. Nghiền mẫu trong 3 ml dung dịch nghiền, gạn lấy 1,5 ml phần dịch vào eppendopf, ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút.
Bước 3: Rửa bản ñĩa bằng PBS-t (3 – 5 lần) Bước 4: Tạo phản ứng kháng thể - kháng nguyên
Nhỏ 100µl dịch mẫu vào mỗi lỗ giếng (mỗi mẫu một cặp lỗ), sau ñó ủ trong tủ ñịnh ôn ở 37oC trong 2 tiếng.
Bước 5: Rửa bản ñĩa bằng PBS-t (3 – 5 lần)
Bước 6: Tạo phản ứng kháng thể - kháng nguyên - Chất cộng hợp (kháng thể
gắn enzym)
Nhỏ 100µl chất cộng hợp ñã pha loãng ở nồng ñộ thích hợp vào mỗi lỗ, sau ñó ủ trong tủ ñịnh ôn ở 37oC trong 2 tiếng.
Bước 7: Rửa bản ñĩa bằng PBS-t (3 – 5 lần) Bước 8: Tạo phản ứng màu.
Viên phản ứng ñược pha trong dung môi phản ứng với nồng ñộ 1mg/ml rồi nhỏ 100µl vào mỗi lỗ giếng, ủ trong tủ ñịnh ôn 37oC, sau ñó tiến hành kiểm tra kết quả ở các thời gian 30, 60 và 90 phút sau khi nhỏ dịch phản ứng.
Bước 9:Kết luận
Căn cứ vào màu vàng ñặc trưng của phản ứng ở mẫu ñối chứng bệnh và màu trong suốt ở mẫu ñối chứng khoẻ.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 48
Nếu ñối chứng có màu vàng ñồng thời ñối chứng khoẻ vẫn trong suốt: Phản ứng cho kết quả tốt.
Tiếp tục so sánh mẫu kiểm tra với các ñối chứng, mẫu nào có màu vàng như ñối chứng bệnh là mẫu nhiễm bệnh và tương tự ñối với mẫu khoẻ.
Mức ñộ ñậm nhạt của màu vàng cũng biểu thị mức ñộ nặng nhẹ của mẫu nhiễm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả quan sát bằng mắt thường có thể ñược số hoá cụ thể bằng máy ñọc ELISA ở bước sóng 405nm.
Phương pháp giám ñịnh nhanh bệnh tristeza bằng que thử nhanh Strip stick Bước 1: Chuẩn bị dịch mẫu (Kháng nguyên)
Mẫu thu thập về ñược rửa sạch, tách gân rồi cân 0,5g/mẫu. Nghiền mẫu trong 3ml dung dịch nghiền ñặc hiệu, ly tâm nhẹ ñể gạn lấy 0,5ml phần dịch trong vào ống tuýp1,7.
Bước 2: Tạo phản ứng
Cắm vào mỗi ống tuýp 1 que phản ứng. ðợi khoảng 30 giây ñến 3 phút, khi que thử ở mẫu ñối chứng bệnh xuất hiện 2 vạch màu nâu rõ rệt và các mẫu khác xuất hiện 1 hoặc 2 vạch nâu là kết luận phản ứng.
Bước 3: Kết luận
- Que thử ở mẫu ñối chứng bệnh xuất hiện 2 vạch màu nâu và que thử ở mẫu ñối chứng khoẻ xuất hiện 1 vạch nâu: Phản ứng tốt
- Que thử ở mẫu kiểm tra nào xuất hiện 2 vạch như ñối chứng bệnh là những mẫu nhiễm bệnh, que thử chỉ xuất hiện 1 mạch như ñối chứng khoẻ là những mẫu không nhiễm bệnh.
2.4.3.Phương pháp ñiều tra mức ñộ gây hại, quy luật phát sinh phát triển của bệnh phấn trắng và ñốm dầu trên quýt vàng Bắc Sơn.
- Chọn ñiểm ñiều tra: ðiều tra tại các vườn trồng quýt thuộc các xã của huyênh Bắc Sơn. Chon vườn ñại diện về ñiều kiện chăm sóc, tuổi cây, chọn 5 vườn ñại diện cho mỗi chỉ tiêu ñiều tra.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 49
- Phương pháp ñiều tra: ðiều tra theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (ðặng V.T. Thanh; Hà Minh Trung, 1997)[12]. ðiều tra ñịnh kỳ 15 ngày/1lần, mỗi vườn ñiều tra 5 ñiểm theo ñường chéo góc, mỗi ñiểm 4 cây. Mỗi cây ñiều tra theo 4 hướng, mỗi hướng ñiều tra 4 cành. . - Chỉ tiêu theo dõi:
Số lá bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) = Tổng số lá ñiều tra x 100 Σ(a x b) Chỉ số bệnh (%) = N x T x 100 Trong ñó:
a - Số lượng bộ phận ñiều tra bị bệnh của mỗi cấp bệnh tương ứng b - Trị số cấp bệnh của mỗi cấp tương ứng
N - Tổng số bộ phận ñiều tra T - Trị số cấp bệnh của cấp bệnh cao nhất - Cấp 1: < 5 % diện tích lá (quả) có vết bệnh - Cấp 2: 5 – 10 % diện tích lá (quả) có vết bệnh - Cấp 3: > 10– 15 % diện tích lá (quả) có vết bệnh - Cấp 4: > 15 – 20 % diện tích lá (quả) có vết bệnh - Cấp 5: > 20 % diện tích lá (quả) có vết bệnh