và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng, địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Đối t−ợng nghiên cứu: gà, vịt từ 2 tuần tuổi trở lên.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu: Đề tài đ−ợc thực hiện trên địa bàn tỉnh Nam Định và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1.Điều tra hồi cứu về bệnh và thiệt hại kinh tế do dịch cúm gia cầm
gây ra tại Nam Định trong năm 2003 và 2004, so sánh với năm 2005 và 2006. 3.2.2. Theo dõi tình hình thực hiện tiêm vacxin phòng dịch cúm gia cầm tại Nam Định theo Quy định sử dụng vacxin tạm thời của Bộ Nông nghiệp & PTNT.
3.2.3. Xác định đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của gà, vịt đ−ợc tiêm vacxin.
3.2.4. Giám sát virus học đàn gà, vịt đ−ợc tiêm vacxin.
3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
- Số liệu thu thập từ Cục Thống kê, Chi cục Thú y và kết quả điều tra
trực tiếp tại các địa ph−ơng của tỉnh Nam Định, kết quả xét nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
- Bơm tiêm, kim tiêm, tăm bông, hộp xốp, tủ lạnh, dung dịch bảo quản dịch ổ nhớp, dụng cụ bảo hộ lao động.
- Vacxin cúm gia cầm H5N1, H5N2 vô hoạt nhũ dầu của Trung Quốc. - Trang thiết bị, hóa chất thí nghiệm dùng trong chẩn đoán, xét nghiệm cúm gia cầm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng.
- Huyết thanh của gà, vịt. - Dịch ổ nhớp của gà, vịt.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h36 ọc Nụng nghiệp ------ 36
- Hồng cầu gà đ−ợc lấy từ gà hoàn toàn khỏe mạnh về lâm sàng và trong huyết thanh không có kháng thể chống Newcastle, cúm gia cầm.
- Gà, vịt từ 2 tuần tuổi trở lên, khỏe mạnh về lâm sàng.
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu
- Ph−ơng pháp thu thập số liệu, điều tra hiện trạng, lấy mẫu ngẫu nhiên,
khách quan, trung thực.
- Ph−ơng pháp vận chuyển, bảo quản, sử dụng vacxin và kỹ thuật tiêm phòng thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất vacxin.
- Xác định hiệu giá kháng thể và độ dài miễn dịch của gà, vịt đ−ợc tiêm vacxin bằng phản ứng HI.
- Giám định virus cúm gia cầm chủng H5N1 bằng phản ứng RT-PCR. - Xử lý số liệu bằng ph−ơng pháp thống kê sinh học trên Excel.
Một số ph−ơng pháp th−ờng đ−ợc sử dụng trong chẩn đoán cúm gia cầm nh− sau [29]:
* Phản ứng HI - Nguyên liệu
+ Kháng nguyên chuẩn: kháng nguyên là virus cúm subtyp H5 chuẩn.
Pha kháng nguyên H5 cho phản ứng HI là 4 đơn vị HA/25àl.
+ Hồng cầu: hỗn dịch hồng cầu 1% đ−ợc chuẩn bị từ hồng cầu gà trống tr−ởng thành (1,3kg), không có kháng thể cúm và Newcastle đ−ợc lấy máu ở tĩnh mạch cánh bằng seringer 5ml có chứa 1ml Natri citrat 5%.
Rửa hồng cầu: cho PBS (pH 7,2) vào ống ly tâm chứa hồng cầu lắc nhẹ. Ly tâm 1000-1500 vòng/1 phút trong 10 phút. Đổ bỏ huyết t−ơng ở trên, cho PBS rửa hồng cầu tiếp 2-3 lần đến khi dung dịch ở phía trên trong là đ−ợc.
Pha hồng cầu 1%: đổ bỏ n−ớc trong ở trên, lấy 1 ml hồng cầu cho vào
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h37 ọc Nụng nghiệp ------ 37
+ Huyết thanh: huyết thanh làm phản ứng đ−ợc chắt từ mẫu máu, bảo
quản ở 4-80C.
- Phản ứng ng−ng kết hồng cầu ( HA)
Phản ứng HA dùng để chuẩn độ kháng nguyên chuẩn H5 và kháng nguyên (là virus) phân lập từ bệnh phẩm. Dùng đĩa làm phản ứng ng−ng kết đáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng.
+Tiến hành phản ứng:
Cho 25àl PBS (pH 7,2) vào tất cả các giếng.
Cho 25 àl kháng nguyên chuẩn hoặc kháng nguyên phân lập vào các
giếng từ A1 H1.
Pha lotng bậc 2 kháng nguyên kiểm tra. Chuyển 25 àl từ giếng 1 đến
giếng 11 rồi bỏ đi 25 àl.
Cột 12 dùng đối chứng chỉ chứa: 25 àl PBS và 25 àl hồng cầu gà 1%.
Cho 25 àl hồng cầu gà 1% vào các giếng phản ứng.
Lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Đọc kết quả.
+ Đọc kết quả:
Phản ứng (-) : hồng cầu lắng đều ở d−ới đáy.
Phản ứng (+): xảy ra hiện t−ợng ng−ng kết, hồng cầu ng−ng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.
Đọc hiệu giá ng−ng kết: hiệu giá ng−ng kết kháng nguyên đ−ợc đánh giá ở độ pha lotng cao nhất còn có phản ứng ng−ng kết xảy ra.
- Phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI)
Nhỏ 25 àl PBS vào các giếng đáy chữ V của đĩa 96 giếng.
Nhỏ tiếp 25 àl huyết thanh vào giếng đầu tiên.
Pha lotng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cách chuyển 25 àl huyết thanh
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h38 ọc Nụng nghiệp ------ 38
Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4 HA đt chuẩn bị vào các giếng từ giếng 1-
11. Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12)
Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng của đĩa, lắc đều.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.
Đọc kết quả: phản ứng (+) d−ơng tính nếu hồng cầu lắng xuống đáy. Hiệu giá HI của mẫu đ−ợc tính ở độ pha lotng huyết thanh cao nhất còn có hiện t−ợng ức chế ng−ng kết hồng cầu.
* Phản ứng RT-PCR
- Chiết tách ARN bằng Trizol
+ Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1 ml Trizol reagent) + 0,25
ml dịch bệnh phẩm vào ống 1,5 ml. Lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5 phút. + Thêm 0,2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Ly tâm ống ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.
+ Chuyển phần n−ớc (khoảng 500 àl) sang ống microtube mới.
+ Thêm 0,5 ml Isopropanol và lắc đều. Để 5-10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Ly tâm ống ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Bỏ dung
dịch trong ống đi.
+ Rửa ARN đóng ở đáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc
độ 10.000 g trong 5 phút ở 40C.
+ Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt độ phòng và
hoà tan lại với 30 àl n−ớc cất không có Rnase hoặc n−ớc cất đt xử lý DEPC.
- Tiến hành phản ứng RT-PCR
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h39 ọc Nụng nghiệp ------ 39 H2O 12 àl 5X Buffer 5 àl dNTP 1àl Enzyme mix 1àl Primer forward 0,5 àl Primer reverse 0,5 àl Mẫu ARN 5 àl Tổng cộng 25 àl
- Chu trình nhân gen
600C - 1 phút 420C -10 phút 420C - 500C - 30 phút 950C - 15 phút 940C - 30 giây (tách sợi) 500C - 30 giây (gắn Primer) 720C - 1 phút (kéo dài) Chu trình 35 - 40 vòng 720C - 10 phút Giữ ở 40C
Quy trình nhân gen này áp dụng cho primer H5 (F 936 và R 1299) và N1 (F6 và R595).
- Chạy điện di
+ Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha trong dung dịch TAE hoặc TBE có
Ethidium Bromide (10 àg/àl).
+ Đổ thạch vào khuôn điện di (có l−ợc).
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h40 ọc Nụng nghiệp ------ 40
+ 2àl dung dịch loading buffer).
- Sử dụng Marker trọng l−ợng phân tử (thang 100 bp).
- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu đối chứng d−ơng và đối chứng âm đi kèm (mẫu đối chứng âm tính có thể là n−ớc cất sạch).
- Đọc kết quả
+ Mẫu d−ơng tính: xuất hiện vạch giống với mẫu đối chứng d−ơng tính. + Mẫu âm tính: không có vạch.
- Đánh giá kết quả: có virus cúm hoặc virus cúm thuộc subtyp nào dựa vào primer chạy mẫu.
* Phân lập virus trên phôi gà
Phân lập virus từ mẫu dịch ổ nhớp, dịch hầu họng, bệnh phẩm bằng cách tiêm vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi.
- Tiêm truyền trên phôi gà
+ Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên. + Sát trùng vỏ trứng và đục 1 lỗ trên buồng hơi.
+ Dùng syringer tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ đt đục vào túi niệu, l−ợng 0,1 - 0,2 ml huyễn dịch /trứng. Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm 3 trứng.
+ Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin.
+ ấp trứng ở 37oC trong 7 ngày.
- Thu hoạch n−ớc trứng
+ Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ âm - 200 C
trong 30 phút.
+ Dùng panh kẹp hoặc kéo nhỏ đầu nhọn mở nắp trứng ở phía buồng hơi. + Hút n−ớc niệu mô bằng pipet, cho vào ống nghiệm 10 ml.
+ Bảo quản n−ớc trứng đt thu hoạch đ−ợc trong tủ âm -700C.
+ Mẫu đt phân lập đ−ợc kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần.
Trường ðại học Nụng nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa h41 ọc Nụng nghiệp ------ 41