4.1. Kết quả phục hồi và nuôi cấy tế bào BHK-21
Chúng tôi tiến hành hồi phục và nhân tế bào BHK-21 từ 1 ống tế bào giống gốc ban đầu ra chai nuôi tế bào T25. Giống gốc tế bào BHK-21 đ−ợc bảo quản bằng dung dịch DMSO 10%, giữ trong Nitơ lỏng, tại Bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y. Sử dụng môi tr−ờng DMEM đầy đủ, có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê để hồi phục tế bào. Giữ tế bào ở tủ ấm 37 0C/5% CO2, quan sát sự phát triển của tế bào, chúng tôi nhận thấy:
- Ngay sau khi nuôi cấy tế bào vào chai T25, tế bào ở trạng thái lơ lửng, hình tròn, lắng dần xuống đáy.
- Sau khi ra chai 6 giờ, có thể quan sát thấy một số tế bào bắt đầu bám vào đáy chai nuôi, phát triển kéo dài ra, hình thành hai đầu nhọn.
- Sau 12 giờ, các tế bào bám vào đáy chai nuôi, phát triển dài hơn, hình thành từng cụm nhỏ.
- Sau 24 giờ, những cụm tế bào phát triển rộng, v−ơn dài ra và bám dính với nhau.
- Sau 36 giờ, các cụm tế bào v−ơn dài bắt đầu gặp nhau nh−ng mật độ vẫn còn th−a, chỉ phủ khoảng <50% diện tích đáy chai nuôi.
- Sau 48 giờ, tế bào phát triển dày hơn, phủ khoảng trên 80% đáy diện tích chai nuôi.
- Sau 60 giờ, tế bào phủ kín đáy chai nuôi (hình 4.1).
Qua theo dõi quá trình phục hồi và phát triển của tế bào BHK-21, chúng tôi nhận thấy một số đặc điểm chính sau đây:
- Hình thái tế bào BHK-21 dài thuôn nhọn về hai đầu. - Tế bào bám dính vào đáy chai nuôi.
Những đặc điểm về hình thái, tính chất mọc của tế bào là không thay đổi và phù hợp với các thông số kèm theo trong lý lịch gốc, đảm bảo các tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứu.
4.2. Kết quả gây nhiễm virus lở mồm long móng lên tế bào BHK-21
Tr−ớc khi gây nhiễm huyễn dịch virus LMLM lên tế bào BHK-21 24 giờ, chúng tôi chọn chai tế bào nuôi cấy có tế bào đ] mọc tốt và tiến hành tách tế bào. Ra chai với số l−ợng tế bào 5x106 tế bào/ml. Sau 24 giờ, tế bào phát triển tốt, phủ đều một lớp bề mặt đáy chai (hình 4.2).
Huyễn dịch virus LMLM đ−ợc giải đông tan từ tủ lạnh âm 80OC, pha lo]ng 10-3 trong PBS và gây nhiễm 2ml/chai tế bào T25 nh− đ] mô tả trong phần ph−ơng pháp. Giữ tế bào ở tủ ấm CO2/37 OC, quan sát sự phát triển/phá huỷ của tế bào. Kết quả quan sát sự phá huỷ tế bào của virus PV02 sau 24 và 48 h đ−ợc ghi nhận ở hình 4.2.
Nhận xét:
- ở chai tế bào không gây nhiễm virus, sau 24 giờ, tế bào phát triển, phủ đáy chai dày hơn tr−ớc đó; sau 48 giờ, xuất hiện một số tế bào chết (co tròn), nh−ng những tế bào ở lớp dày bên d−ới có hình dạng bình th−ờng.
- Ng−ợc lại ở chai tế bào gây nhiễm virus PV02, 24 giờ sau gây nhiễm, tế bào phát triển không bình th−ờng, có nhiều tế bào bị biến dạng với nhiều thể tròn, một số tế bào có dạng tròn to nhỏ khác nhau, bong khỏi bề mặt, phản ảnh hiện t−ợng huỷ hoại do virus. Số l−ợng tế bào chết và bong ra xuất hiện nhiều hơn ở thời điểm 52 giờ (>50%). Tại thời điểm 60 giờ, hầu hết tế bào bị co tròn, bong khỏi đáy chai.
Chúng tôi thu huyễn dịch virus bằng cách đông tan 3 lần ở âm 800C. Huyễn dịch đ−ợc chia vào các ống 1.5 ml, nút vặn, bảo quản ở âm 80OC đến khi sử dụng.
Hình 4.2. Hình ảnh tế bào BHK-21 sau gây nhiễm virus PV02 (tr−ớc gây nhiễm, 24 và 48 giờ sau gây nhiễm)
4.3. Kết quả thiết lập RT-PCR định týp virus lở mồm long móng
Chúng tôi thiết lập phản ứng RT-PCR để định týp virus LMLM bằng cách: sử dụng 3 chủng virus tham chiếu (đ] biết týp O, A và Asia1), các cặp mồi đặc hiệu cho các týp và cho riêng từng týp virus LMLM, bao gồm:
- Cặp Puni R-F cho tất cả các virus LMLM
- Cặp primer Puni-P38 đặc hiệu cho týp O, Puni-P87 đặc hiệu cho týp A và Puni-P74 đặc hiệu cho týp Asia1.
Kết quả RT-PCR đối với các mẫu virus chuẩn đ−ợc trình bày ở hình 4.3. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ch−a sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho các týp C và SAT vì cho đến thời điểm này, virus LMLM các týp C, SAT1, SAT2 và SAT3 ch−a từng có mặt ở Việt Nam, cũng nh− ở các n−ớc trong khu vực.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR sử dụng các cặp primer đặc hiệu týp đối với các mẫu virus chuẩn
[Bố trí: cột 1- 4: virus týp O; cột 5-8: virus týp A và cột 10-13: virus týp Asia1. Đối với mỗi virus có hai cặp primer đ−ợc dùng: cặp 1- Puni; cặp 2- primer đặc hiệu týp. Cột 9 (M): thang 100 bp DNA chuẩn].
Nhận xét:
1. Các cột: 2, 4, 6, 8, 11 và 13, t−ơng ứng các mẫu đối chứng âm, không cho vạch DNA (không có virus) là hợp cách;
2. Cặp primer Puni cho vạch khoảng 350 bp (328 bp- theo thiết kế) ở các cột 1, 5 và 10, cho thấy: Puni cho sản phẩm PCR có cùng độ dài ở cả 3 týp khi có virus trong mẫu; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Sản phẩm PCR có độ dài khác nhau đối với các týp khác nhau:
Cột 3: Cặp Puni-38, đặc hiệu týp O, cho vạch 400 bp (402 bp theo thiết kế) Cột 7: Cặp Puni-87, đặc hiệu týp A, cho vạch trên 700 bp (732bp theo thiết kế)
Cột 12: Cặp Puni-74, đặc hiệu týp Asia1, cho vạch d−ới 300 bp (292 bp theo thiết kế)
Kết quả ở hình 4.3 cho thấy: cặp primer Puni cho vạch đặc hiệu 328 bp đối với các chủng, có thể dùng để phát hiện sự có mặt của virus LMLM ở mẫu vật. Cặp P38, P87 và P74 cho sản phẩm đặc hiệu t−ơng ứng đối với týp O, A và Asia1, có thể dùng để xác định týp virus LMLM ở mẫu vật.
4.4. RT- PCR xác định sự có mặt của virus PV02
Tr−ớc khi thực hiện RT-PCR định týp virus LMLM, theo th−ờng quy, chúng tôi cần biết rõ nếu có virus ở trong mẫu phân tích và l−ợng virus có ở mức phát hiện đ−ợc bằng RT-PCR.
Mặc dù trong thí nghiệm gây nhiễm trên đây (hình 4.2), virus PV02 gây huỷ hoại tế bào khá rõ ràng, chúng tôi vẫn tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu bằng RT-PCR sử dụng cặp primer Puni R-F. Sản phẩm RT-PCR đ−ợc trình bày ở hình 4.4:
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng FMD uni-primer đối với mẫu tế bào gây nhiễm virus PV02
[Bố trí: cột 1: Mẫu PV02; cột 2: Thang 100 bp DNA chuẩn; cột 3: Tế bào BHK-21 không nhiễm virus; cột 4: Huyễn dịch virus LMLM tham chiếu týp O].
Nhận xét:
- Sản phẩm PCR khoảng 350 bp (328 bp nh− thiết kế) có ở đối chứng d−ơng chuẩn (cột 4) và không có ở đối chứng âm (cột 3), chứng tỏ RT-PCR đ] đ−ợc thực hiện đúng.
- Sản phẩm PCR đ−ợc tìm thấy ở cột 1 (mẫu PV02 cần xác định) với độ dài/trọng l−ợng phân tử t−ơng đ−ơng với đối chứng d−ơng ở cột 4, chứng tỏ: huỷ hoại tế bào BHK-21 quan sát đ−ợc ở hình 4.2 là do virus LMLM PV02 và nồng độ virus PV02 trong huyễn dịch virus-tế bào đủ cho các phân tích bằng RT-PCR.
4.5. Kết quả RT-PCR định týp virus lở mồm long móng PV02
Chúng tôi tiến hành định týp chủng virus LMLM PV02 áp dụng:
1. Các điều kiện RT-PCR và các cặp primer đặc hiệu týp trên các mẫu virus tham chiếu đ] thiết lập ở mục 4.3 (nh− trình bày ở hình 4.3), và
2. Sử dụng mẫu cDNA chuẩn bị ở mục 4.4. Kết quả RT-PCR cho định týp virus LMLM chủng phân lập PV02 đ−ợc trình bày ở hình 4.5:
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
m Hình 4. 5. Sản phẩm RT-PCR trong định týp virus LMLM PV02 [Bố trí: Sản phẩm PCR sử dụng Puni (cột 1: PV02, cột 2 đối chứng âm); dùng cặp primer P38 đặc hiệu cho từng týp O (cột 3: PV02, cột 4: đối chứng âm, cột 5: chủng tham chiếu týp O); cặp primer P87 đặc hiệu cho từng týp A (cột 7: PV02, cột 8: đối chứng âm, cột 9: chủng tham chiếu týp A); cặp primer P74 đặc hiệu cho từng týp Asia1 (cột 10: PV02, cột 11: đối chứng âm, cột 12: chủng tham chiếu týp Asia1); Cột 6 (M) thang 100 bp DNA chuẩn].
Nhận xét:
Từ kết quả có đ−ợc ở hình 4.5 cho thấy:
1. PCR dùng uni-primer, kiểm tra sự hiện diện của cDNA PV02, cho vạch đặc hiệu 328 bp (cột 1) và không có vạch (không có sản phẩm PCR) ở mẫu đối chứng âm. Nh− vậy, PCR đ] đ−ợc thực hiện đúng và l−ợng cDNA ở mẫu virus LMLM PV02 đảm bảo cho PCR định týp.
2. Đối với các cặp primer đặc hiệu cho từng týp, chỉ có đối chứng d−ơng sử dụng virus tham chiếu, cho các vạch đặc hiệu: 402 bp cho týp O, cặp mồi P38 (cột 5); vạch 732 bp cho týp A, cặp mồi P87 (cột 9); và vạch 292 bp cho týp Asia1, cặp mồi P74 (cột 12). Các đối chứng âm không cho vạch, chứng tỏ PCR đ] thực hiện đúng cách. Tuy nhiên, không có vạch (âm tính) ở các cột t−ơng ứng với týp O, A hay Asia1 đối với mẫu PV02 (cột 3, 7 và 11).
Kết quả RT-PCR định týp virus chủng phân lập PV02 âm tính, có thể do các nguyên nhân sau đây:
1. Virus LMLM chủng phân lập PV02 không thuộc các týp O, A và Asia1.
2. Virus LMLM chủng phân lập PV02 có thể thuộc một trong các týp O, A hoặc Asia1, nh−ng hệ gene của chủng này đ] thay đổi, ít nhất ở vùng primer bắt cặp.
3. Thao tác kỹ thuật một lần có thể có sai sót.
Để loại trừ khả năng thứ 3, chúng tôi đ] lập lại thí nghiệm 3 lần, cả PCR và thí nghiệm lập lại từ b−ớc chuẩn bị RNA qua 2 lần, kết quả định týp vẫn âm tính.
Với khả năng thứ 1, để xác định nếu virus LMLM chủng phân lập PV02 không thuộc về hay khác với 3 týp O, A và Asia1, ph−ơng pháp Capture (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ELISA đ] đ−ợc dùng để xác định serotype của chủng phân lập. Kết quả Capture ELISA của Bộ môn Hóa sinh, Miễn dịch- Bệnh lý- Viện Thú y và Trung tâm chẩn đoán Thú y trung −ơng- Cục thú y, đều đi đến kết luận: Kháng nguyên của virus LMLM chủng phân lập PV02 thuộc týp O.
Đối với khả năng thứ hai, các tr−ờng hợp có thể bao gồm:
(a) Virus LMLM chủng phân lập PV02, chỉ đơn thuần có những đột biến tại vùng primer bắt cặp mà những sai khác về thông tin di truyền ch−a dẫn đến những biến đổi cơ bản về kháng nguyên tính (nghĩa là: ch−a biến thành phân chủng khác)
(b) Virus LMLM chủng phân lập PV02 là một topotype mới. Cho đến nay, ng−ời ta đ] xác định đ−ợc 10 topotype của serotype O [44], phân bố theo vùng l]nh thổ, trong đó, các topotype chính bao gồm: PanAsia, Cathay, WA, SEA1 và SEA2. Trong số 5 topotype này thì topotype WA (Đông Phi) mới xuất hiện vào những năm cuối thập kỷ tr−ớc. Do vậy, khả năng topotype mới xuất hiện ở địa ph−ơng PV cần đ−ợc làm sáng tỏ trong t−ơng lai.
Trong cả hai tr−ờng hợp vừa nêu, tr−ớc hết cần có thông tin về trình tự nucleotide của chủng phân lập, trên cơ sở đó, các phân tích về quan hệ họ hàng có thể cho biết nguồn gốc của chủng phân lập và mức độ biến đổi của nó.
4.6. RT-PCR với týp O chuẩn và týp O PV02
Khi đ] biết virus LMLM chủng phân lập PV02 thuộc serotype O, để xem xét khả năng chỉ có vài biến đổi nhỏ tại vùng primer bắt cặp, chúng tôi đ] lập lại thí nghiệm so sánh chỉ týp O chuẩn với PV02, kể cả khi hạ thấp nhiệt độ cho bắt mồi (b−ớc annealing), vạch đặc hiệu týp O, 402 bp vẫn chỉ nhận đ−ợc ở đối chứng d−ơng chuẩn (tham chiếu týp O), đối với PV02, vẫn không cho sản phẩm (xem hình 4.6).
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR của virus LMLM chủng phân lập PV02 và chủng tham chiếu týp O, dùng các cặp primer chung cho các týp (PuniR-F)
và cặp mồi đặc hiệu cho týp O (P33/P38)
[Bố trí: Phía trái gel, RT-PCR dùng Puni: Cột 1- PV02, cột 2- virus týp O tham chiếu, cột 3- đối chứng âm; Cột 4- thang 100 bp DNA chuẩn. Phía phải của gel, RT-PCR dùng primer P38 đặc hiệu týp O: Cột 5- PV02, cột 6 - virus týp O tham chiếu, cột 7- đối chứng âm].
Nhận xét:
Qua kết quả thể hiện trên hình 4.6, chúng tôi nhận thấy:
1. Primer Puni, sử dụng chung đối với tất cả các týp virus LMLM, cho kết quả d−ơng tính đối với cả chủng tham chiếu týp O và chủng cần phân tích PV02, chứng tỏ một lần nữa PV02 là virus LMLM và vật liệu cDNA của PV02 đủ làm xuất hiện vạch (sản phẩm PCR) t−ơng đ−ơng với chủng tham chiếu týp O.
2. Cặp primer P38 cho vạch 402 bp đặc hiệu chỉ ở chủng tham chiếu týp O mà không cho vạch đối với chủng cần phân tích PV02, tức là không có sản
phẩm PCR tạo ra, điều này chứng tỏ đ] không có quá trình nhân lên đặc hiệu trong phản ứng PCR với mẫu PV02. Virus LMLM týp O chủng phân lập PV02 đ] biến đổi đặc tính di truyền, ít nhất là trình tự chuỗi nucleotide tại điểm primer bắt cặp, và rất có thể PV02 là một biến chủng hoặc 1 topotype mới xuất hiện tại địa ph−ơng PV.
Để làm sáng tỏ vấn đề này, việc giải trình tự tại vùng gene mà primer bắt cặp để biết đ−ợc nguyên nhân biến đổi là cần thiết, đồng thời trên cơ sở đó, thiết kế lại cặp mồi đặc hiệu cho hầu hết các biến chủng/ topotype týp O và cặp mồi đặc hiệu cho biến chủng này. Để giải trình tự gene, một yêu cầu đặt ra là cần có DNA tinh khiết của virus PV02. Việc tạo ra DNA tinh khiết phải trải qua nhiều b−ớc song công việc đầu tiên cần tiến hành là nhân dòng sản phẩm PCR. Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR đ] đ−ợc tạo ra để tách và nhân dòng.
4.7. Kết quả tách và nhân dòng sản phẩm PCR mẫu PV02
Để phục vụ cho việc nhân dòng, cần có 200àl sản phẩm PCR của mẫu PV02. Do đó, chúng tôi thực hiện RT-PCR nh− th−ờng quy nh−ng tăng thể tích và số l−ợng các thành phần tham gia phản ứng so với thông th−ờng. Sản phẩm của phản ứng sau đó đ−ợc chạy điện di trên agarose gel, nhuộm gel bằng Ethidium Bromide và chụp ảnh bằng hộp đèn tử ngoại. Kết quả đ−ợc hiển thị trên hình 4.7:
PV02 PV021 2 3 1 2 3 100 bp DNA Marker Hình 4.7. Sản phẩm RT-PCR sử dụng cho nhân dòng
[Bố trí: cột 1, 3 là sản phẩm PCR của mẫu PV02; cột 2 là thang 100bp DNA chuẩn]
Nhận xét:
Sản phẩm RT-PCR cho vạch nh− dự kiến. L−ợng sản phẩm thu đ−ợc đủ so với yêu cầu của phản ứng nhân dòng.
Sau khi đ] có đủ l−ợng sản phẩm PCR dùng cho phản ứng nhân dòng, chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh khiết sản phẩm PCR từ agarose gel sử dụng quy trình của QIAEX II Gel Extraction Kit. Kiểm tra lại sản phẩm DNA đ] đ−ợc tách chiết, bằng ph−ơng pháp điện di trên agarose gel (2% agarose trong 1x TAE). Gel đ−ợc nhuộm trong Ethidium Bromide 15 phút. Kết quả sau khi chạy điện di đ−ợc thể hiện trên hình 4.8:
Hình 4.8. Kiểm tra sản phẩm PCR đã đ−ợc tinh khiết từ agarose gel
[Bố trí; cột 1, 2, 3 là sản phẩm PCR tinh khiết t−ơng ứng của mẫu PV02, QT55, GL03. Cột 4 là thang 100bp DNA chuẩn. Cột 5, 6, 7, 8 là mẫu DNA chuẩn pha lonng ở các nồng độ khác nhau (1/2, 1/4, 1/8, 1/16)].
Nhận xét:
Cột 1, 2, 3 xuất hiện vạch đặc hiệu chứng tỏ đ] tinh khiết thành công sản phẩm PCR từ agarose gel
So sánh vạch DNA của mẫu PV02 với vạch DNA chuẩn đ] pha lo]ng, cho