và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng nghiên cứu
Virus lở mồm long móng týp O của Việt Nam.
3.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Hoá sinh – Miễn dịch và Bệnh lý, Viện Thú y. Viện Công nghệ sinh học
3.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 12 năm 2005 đến tháng 6 năm 2006.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Phân lập virus LMLM trên tế bào BHK-21
3.4.2. Xác định sự có mặt của virus bằng kỹ thuật RT-PCR dùng universal primer
3.4.3. Thử các cặp mồi đặc hiệu xác định týp O chủng phân lập tại Việt Nam 3.4.4. Dòng hoá gene VP1 của chủng phân lập
3.4.5. Xác định trình tự nucleotide của clone
3.4.6. So sánh trình tự nucleotide chủng phân lập với chủng đã công bố trên thế giới
3.5. Nguyên liệu
3.5.1. Giống virus lở mồm long móng, tế bào BHK-21
Các giống virus chuẩn týp O, A và Asia1 và chủng phân lập PV02 do Bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch và Bệnh lý - Viện Thú y cung cấp.
Giống tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney line 21) do Bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch và Bệnh lý, Viện Thú y cung cấp.
3.5.2. Hoá chất, môi tr−ờng thí nghiệm
* Hoá chất, môi tr−ờng nuôi cấy tế bào
- Môi tr−ờng DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) - Dung dịch NaHCO3 7.5%
- L- Glutamin - Trypsin
- EDTA (C10H14N2Na2O8.2H2O)- Disodium Dihydrogen Ethylene Diamine Tetraacetate Dihydrate)
- DMSO (Dimethyl Sulfoxide)
- Kháng sinh (Penicilline, Streptomycine) - Kháng nấm (fungizone)
* Các hóa chất, sinh phẩm cho RT-PCR
+ Các chất dùng để tách RNA của virus:
- Trizol (1ml Trizol/ 2ml hỗn dịch) - PBS
- Chloroform
- Iso- propyl alcohol - Ethanol 70%
+ Men sao chép ng−ợc: (Reverse Transcriptase- Promega M170B, 200U/àl) + Các chất tạo phản ứng PCR:
- Random primers (Promega C118A) - Primes đặc hiệu cho týp O
- First strand buffer 5x (Promega M531A) - BSA (Promega R396A, 1mg/ml)
- dNTP mix (2.5mM mỗi loại) - DTT (100mM, Promega P117A)
- Nuclease-free water (Promega P119A- 21787501) - PCR buffer 10x
- MgCl2, 25mM, 750 àl (A351B, 15913112, Promega). - Taq- DNA Polymerase (5 units/ml, 250units, Sigma). + Các chất dùng kiểm tra sản phẩm PCR:
- Agarose gel 2% (agarose pha trong TBE/TAE). - Ethidium Bromide và Marker.
- Dung dịch TBE/TAE Buffer 1x. - DNA marker
* Các hóa chất cần thiết cho chiết tách DNA: + Agarose gel 2% (pha trong dung dịch TAE) + TAE Buffer
+ Maker
+ Ethidium Bromide + Dung dịch TE + DNA extraction Kit
* Hoá chất dùng cho biến nạp tế bào
+ Môi tr−ờng LB: (Tryptone, Yeast Extract, Nacl, Ampicillin) + Thạch LB (môi tr−ờng LB + Agarose)
+ TOPO TA Cloning Kit
+ Các loại hoá chất thông th−ờng phòng thí nghiệm khác.
3.5.3. Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi tế bào (T25, T75, T150)
- Pipette chính xác 10 àl, 20 àl, 200 àl, 1000 àl
- Đầu côn t−ơng ứng loại 10 àl, 20 àl, 200 àl, 1000 àl - Eppendorf tube 1,5 ml, 500 àl, 200 àl, ống ly tâm 15 ml.
- Khay đựng Eppendorf, thùng đá, găng tay, bông, cồn, dụng cụ cấy, cân, máy đọc gel, dao cắt gel, túi lynon đựng gel, kính, Saran warp, đĩa lồng Petri, tăm vô trùng...
- Buồng cấy vô trùng
- Tủ ấm 370 C th−ờng và tủ ấm 370 C có 5% CO2 - Bể ấm có lắc (Water bath)
- Nồi hấp tiệt trùng
- Các loại tủ lạnh 40 C, -300 C, -800 C - Máy lắc gia nhiệt
- Máy chạy PCR: Autorisierter Thermocycler
- Máy chạy điện di (Mini Gel Migration Trough- Cosmo Bio Co.Ltd) - Máy đọc và chụp ảnh gel: Imaging Analyzer (ChemiDoc Bio- Rad) - Máy hút chân không
- Máy ly tâm bàn Eppendorf 5415R - Máy ly tâm lạnh Eppendorf
- Máy Vortex Genie 2
3.6. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.6.1. Thu thập bệnh phẩm
Bệnh phẩm đ−ợc thu thập theo h−ớng dẫn của phòng thí nghiệm tham chiếu virus LMLM Pirbright và OIE [20], [56].
3.6.2. Nuôi cấy tế bào và gây nhiễm virus gây bệnh lở mồm long móng
3.6.2.1. Phục hồi tế bào BHK-21
Giống gốc tế bào BHK-21 đ−ợc bảo quản trong nitơ lỏng, giữ ở Bộ môn Hoá sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y.
Tr−ớc khi tiến hành cần chuẩn bị: 7ml môi tr−ờng đầy đủ (1x DMEM 10% huyết thanh bào thai bê), làm ấm trong tủ ấm 370 C trong 30 phút tr−ớc khi bắt đầu mở giống.
Thực hiện phục hồi tế bào theo các b−ớc sau đây:
B−ớc 1. Giải đông:
Lấy 1 ống tế bào BHK-21 giống gốc ra khỏi Nitơ lỏng, đặt vào cốc n−ớc sạch, để ở nhiệt độ phòng, quan sát đến khi khối tế bào đông chuyển màu (từ hồng đậm sang hồng nhạt) khi đ] tan đông.
B−ớc 2. Cân bằng môi tr−ờng:
Thêm 1ml môi tr−ờng DMEM đầy đủ (đ] làm ấm ở 370C) vào ống tế bào. Chuyển huyễn dịch tế bào sang ống ly tâm 15ml.
B−ớc 3. Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản:
Ly tâm 700 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần dung dịch ở trên (giữ lại cặn tế bào màu trắng).
B−ớc 4. Hòa tan cặn tế bào bằng môi tr−ờng nuôi cấy tế bào:
Thêm vào ống tế bào 6ml môi tr−ờng đầy đủ, gõ nhẹ vào đáy ống để hòa tan tế bào.
B−ớc 5. Cấy tế bào vào chai nuôi:
Chuyển huyễn dịch tế bào (6ml) vào chai nuôi tế bào 25cm2 (sử dụng chai T25 của h]ng Corning) ghi tên tế bào nuôi, ngày, giờ nuôi.
B−ớc 6. Theo dõi tế bào phát triển và thay môi tr−ờng nuôi cấy tế bào: Nhẹ nhàng đặt chai nuôi vào tủ ấm 370 C/5% CO2. Hàng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai trên kính hiển vi (và thay môi tr−ờng 2 ngày/lần nếu cần thiết) cho đến khi tế bào phủ kín bề mặt đáy chai nuôi.
3.6.2.2. Nhân số l−ợng tế bào:
Tr−ớc khi tiến hành thí nghiệm, cần xác định số chai tế bào cần nhân, l−ợng môi tr−ờng đầy đủ và không đầy đủ, l−ợng PBS, trypsin, và cân bằng ở 370C.
Khi có 80-90% tế bào phủ kín bề mặt đáy chai nuôi, tiến hành tách tế bào bám dính và cấy chuyển nh− sau:
B−ớc 1. Loại bỏ môi tr−ờng đang nuôi:
Loại bỏ môi tr−ờng trong chai nuôi tế bào (bằng kim, sử dụng máy hút chân không). Thêm vào chai nuôi PBS (-) (không chứa Ca2+ hoặc/và Mg2+) (3ml PBS(-)/chai T25).
B−ớc 2. Trypsin hóa tách tế bào:
Thêm 2ml Trypsin - EDTA, ủ vừa đủ để làm các tế bào tách khỏi đáy bình (trong 3-15 phút, không đ−ợc để tế bào trong trypsin quá thời gian cần thiết). Thêm 7ml môi tr−ờng không đầy đủ (không có huyết thanh bào thai bò để dừng quá trình trypsin hóa), trộn đều, chuyển sang ống ly tâm 15ml.
B−ớc 3. Loại bỏ trypsin:
Ly tâm với tốc độ 700 vòng/phút, trong 5 phút, loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào màu trắng.
B−ớc 4. Cân bằng môi tr−ờng và đếm số tế bào:
5ml hoặc dùng quả bóp đánh mạnh nhiều lần để tế bào tách rời nhau hoàn toàn). Đếm tế bào: Pha lo]ng tế bào 100 lần (10àl trong 990àl môi tr−ờng không đầy đủ), dùng buồng đếm hồng cầu để đếm số tế bào bằng kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
B−ớc 5. Cấy chuyển tế bào:
Đánh dấu chai nuôi tế bào mới (tên dòng tế bào, ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển). Pha lo]ng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi tr−ờng DMEM đầy đủ (có bổ sung kháng sinh, chất chống nấm và 10% huyết thanh bào thai bê (FSC)), vừa đủ thể tích cần nuôi cấy. Chia huyễn dịch tế bào vào các chai nuôi (6ml/chai T25, 15ml/chai T75).
B−ớc 6. Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển:
Giữ chai tế bào nuôi ở 370C/5% CO2, theo dõi th−ờng xuyên sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi, đến khi tế bào mọc dày thành một lớp thì đem gây nhiễm.
3.6.2.3. Gây nhiễm virus lở mồm long móng lên tế bào BHK-21 - Kiểm tra tế bào BHK- 21 vừa phủ 90% đáy chai nuôi tế bào.
- Bỏ môi tr−ờng cũ đi, rửa thảm tế bào một lần bằng 2ml PBS vô trùng. - Bổ sung một l−ợng huyễn dịch virus đủ láng đều bề mặt đáy chai nuôi. - Đặt chai nuôi chứa hỗn dịch tế bào+virus trong tủ 370C/5% CO2 trong 1giờ. - Loại bỏ huyễn dịch virus, rửa 1 lần bằng 2ml PBS.
- Thêm 10ml dung dịch DMEM duy trì. - Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 370C có 5%CO2. * Theo dõi sự hủy hoại tế bào do virus LMLM
- Quan sát sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi trong 2-3 ngày. Sau 1- 2 ngày gây nhiễm huyễn dịch virus thì xuất hiện CPE điển hình. Tế bào nhiễm virus thay đổi hình thái, co tròn, không bám dính, bong tróc từng mảng.
* Thu virus sau gây nhiễm
Khi tế bào trong chai nuôi bị phá hủy ở mức 50% thì có thể cất bảo quản trong tủ lạnh âm cho đến khi sử dụng.
3.6.3. Ph−ơng pháp RT- PCR để chẩn đoán định týp virus lở mồm long móng
3.6.3.1. Tách chiết RNA tổng số - Đông tan tế bào 3 lần.
- Chuyển 100àl huyễn dịch tế bào-virus vào 900àl Trizol trong ống Eppendorf 1.5 ml, lắc trộn đều.
- Giữ 1ml huyễn dịch virus-Trizol ở nhiệt độ phòng (220C) trong 5 phút. - Thêm 200àl Chloroform, lắc mạnh (15 giây) và giữ lại ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
- Ly tâm 12.000 x g trong 15 phút.
- Chuyển 500àl dịch nổi ở pha −a n−ớc có chứa RNA sang ống Eppendorf khác.
- Thêm 500 àl Isopropyl alcohol vào huyễn dịch RNA-Trizol (tỷ lệ1:1), lắc trộn đều để làm kết tủa RNA.
- Giữ dung dịch ở 300C trong 10 phút.
- Ly tâm 12.000 x g trong 10 phút; bỏ dịch trên, thu cặn RNA. - Rửa RNA thu đ−ợc bằng 1ml alcohol 70%, vortex.
- Ly tâm 7.500 x g ở 40C trong 5 phút. Bỏ dịch trên, thu cặn RNA. - Spin lại, dùng pipette loại bỏ đến giọt cồn cuối cùng.
- Làm khô cặn RNA bằng cách mở nắp ống Eppendorf chứa RNA, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Hòa tan RNA trong 15àl Rnase free-water bằng pipetting hoặc vortex. - Giữ RNA trong thùng đá lạnh nếu dùng ngay, hoặc bảo quản ở -70oC cho đến khi sử dụng.
3.6.3.2. Sinh tổng hợp cDNA
Cách làm và các b−ớc của phản ứng đ−ợc thể hiện qua các bảng sau:
Bảng 3.1. Phản ứng Reverse-Transciption
Thành phần phản ứng Thể tích Ghi chú
RNA 5àl
Random primer 2àl 20àl/ml, Promega C118A Rnase free water 5àl Promega P119C
Tổng 12àl
- Giữ hỗn hợp ở 700C trong 5 phút (dùng Rnase free- 0.5ml PCR tube trong Thermocycler); để ở nhiệt độ phòng 10 phút; thêm vào 8.2àl premix sau:
Bảng 3.2. Thành phần premix thêm vào phản ứng
Thành phần Thể tích Ghi chú
Fist strand Buffer 5x 4àl Promega M531 A
BSA (1mg/ml) 2àl Promega R396A, 1mg/ml dNTP mix 1àl
DTT (100mM) 0.2àl Promega P117A
Reverse transcription 1àl Promega M170B, 200u/àl
Tổng 8.2àl
Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó giữ hỗn hợp ở 370C trong 45 phút (dùng Rnase free- 0.5ml PCR tube trong Thermocycler).
Dừng phản ứng, sản phẩm phản ứng đ−ợc sử dụng ngay hoặc bảo quản ở âm 300C.
Quy trình PCR:
* Thiết kế thí nghiệm:
- PCR dùng cặp FMDV-Uni: Phát hiện virus trong thí nghiệm xác định nếu có virus LMLM trong huyễn dịch tế bào BHK-21 sau khi nhiễm virus LMLM PV02.
- PCR dùng các cặp Puni-P38, đặc hiệu phát hiện týp O. - PCR dùng các cặp Puni-P87, đặc hiệu phát hiện týp A. - PCR dùng các cặp Puni-P74, đặc hiệu phát hiện týp Asia1.
Bảng 3.3. Universal primer và các primer đặc hiệu với các týp virus O, A, Asia1
Primer Chiều Chuỗi 5'-3' Týp virus phẩm Sản (bp) 1R Reverse CCA GTC CCC TTC TCA GAT C FMDV-Uni
1F Forward GCC TGG TCT TTC CAG GTC FMDV-Uni