&) Si n\ x⁄ZT—Maonnoprotein Vách tế bào Glucan Chirin ; NÀ
L—————_ enzym chu Không gian
chất chu chất Sử [se =2 <⁄/⁄ z7 E5 |SSS29/601A 9957655555000) <6 C6 Xe CC (SC< (<3 << XXX X (CS) cXXXX°? Màng tế bào Hình 1.5: Bè mặt tế bào nấm men [55]
Neo GPI được tìm thấy ở nhiều protein màng từ protein vỏ của động vật nguyên sinh đến các phân tử nối kết tế bào hữu nhũ. Cấu trúc của neo GPI là một phân tử có tính bảo tổn cao ở nhiều loại sinh vật khác nhau. Cấu trúc lõi của neo GPI ở nấm men tương tự như ở các loại tế bào nhân thực khác, bao gồm [ethanol
amine phosphate mannose (œ-l,2) mannose (ơ-l,6) mannose (œ-1,4) glucosamine (œ-1,6)-inositol phospholipid]. (Hình 1.4 ). Cấu trúc lipid thì khác nhau ở các loại
neo GPI ở nấm men. Nhiều loại protein bể mặt nấm men như Agơl, Agal, Flol, Sedl, Cwpl, Cwp2, Tipl, và Tir1/Srpl có chứa neo GPI đóng một vai trò quan trọng trong việc biểu hiện lên bể mặt các protein trên và cần thiết cho sự tổn tại của nấm men. Một phần các glycophospholipid này gắn nối cộng hóa trị vào đầu C của protein và có vai trò ổn định protein trên màng. Các protein chứa neo GPI có đoạn peptide ky nước ở đầu C. Sau khi hoàn tất tổng hợp, dạng tiển protein được gắn lên màng mạng lưới nội chất nhám bởi trình tự ky nước ở đầu C. Trong vòng
một phút, trình tự ky nước ở đầu C bị cắt bổ ở vị trí œ và đồng thời thay thế bằng
neo GPI bởi enzym transamidase. Vì protein được neo với Hipid bằng nối hóa trị nên
sự gắn protein được thực hiện trên màng mạng lưới nội chất nhám hay màng ngoài
tế bào [51-52].
Thí nghiệm sử dụng các dạng đột biến khuyết trong hệ thống tiết cho thấy rằng sự định vị cả a-agglutinin và œ-agglutinin lên trên bể mặt tế bào xây ra trong suốt quá trình tiết. CẢ AGø! và AGAT đều có trình tự đầu N ky nước với những đặc
điểm tương tự như trình tự tiết đặc hiệu. Protein œ-agglutinin trưởng thành (không
chứa peptide tín hiệu ky nước ở đầu N) bắt đầu từ amino acid 20 của khung đọc mở AGøi, điều nầy nói lên rằng 19 amino acid của trình tự tiết bị cắt bỏ trong quá trình tiết [51-52].
AGzil và AGA1 đều có vùng đầu C ky nước nhưng thiếu tính chất cơ bản của
vùng xuyên màng. Vùng ky nước này giúp gắn protein lên màng tế bào bởi neo
glycosyl phosphatdyHnostol (GPD. Neo GP] hiện diện ở protein bề mặt tế bào có
chức năng khác nhau ở cá tế bào đơn bào và đa bào. Các protein trên được tổng hợp đưới đạng tiên protein với đầu C ky nước. Sau khi protein chuyển ra mạng lưới nội chất nhầm, trình tự này sẽ bị cắt và phần đầu C còn lại sẽ có nối amid với nhóm ethanolamine. Ethanolamine đồng thời tạo nối phosphodiester với C-6 của mannose trong phức hệ giycan. Đầu khử của phức hệ gliycan tiếp theo được nối với inositol của phosphoinositide. Phức hệ này sẽ chuyển sang thể Golgi và từ đây
chuyển lên màng tế bào bằng túi tiết. Sự dung hợp của túi tiết và màng tế bào làm cho protein biểu hiện trên màng tế bào. Kết quả là protein được neo trên bể mặt tế bào bởi neo GPI [51-52].
Trang 23 GPi LINKAGE _ “=== _ protein ö ' Ẫ CHR Gicine CH-- O{ P- O- CH-CH; NH- |C = O Ô chanoonic ————> Q- C-terminal l ¡ 0H} Phogphoethanolamlre residue ©® 0H OH @-P _ Mannosa hrnnose Glt:osamine
12ddiioral fatly acid Bà: Ỉ plasma rnembrane ——>——-
Hình 1.6: Cấu trúc neo GPI [58]
Đầu C của ơœ-agglutinin không đủ dài để cho phép màng tế bào gắn protein trưởng thành và đồng thời biểu lộ phần gắn của agglutinin ra bể mặt tế bào do bề
mặt tế bào dày từ 100- 200nm. Hơn nữa, agglutinin có thể bị tách ra khỏi tế bào bởi enzym ÿ-glucanase. Bởi vậy, œ-agglutinin chỉ có khả năng là gắn trên thành tế bào. Phân tử œ-agglutinin được chuyển qua màng tế bào bằng neo GPI, sau đó được gắn trên bể mặt vách tế bào. Quá trình này bao gồm sự cắt một phần của GPI bằng
phản ứng chuyển vị trans-glycosyl hóa hoặc một số phản ứng khác. Khác với những đường ở đầu C và đầu N, việc cắt bỏ phần đường của neo GPI phải được cắt từ peptide, vì vậy phản ứng chuyển vị trans-glycosyl hóa là cần thiết. Người ta cũng nhận thấy rằng gen AGA/ cũng có đầu C ky nước nên giả thuyết được đề xuất là œ- apglutinin cũng được neo trên vách tế bào nấm men tương tự như a-agglutinin. Phức hệ protein và neo GPI bị cắt khỏi màng tế bào bằng enzym
phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC) và chuyển ra vùng ngoài cùng của thành tế bào. œ-Agglutinin được gắn trên thành tế bào thông qua liên kết
B1,6 glucan vào phần neo GPI còn lại trên phân tử œ-agglutinin [51-52].
—— neo GPỊ
d2 œ-ÃÂgglutinin
Cắt bằng PI-PLC
: : \ và nối hóa trị với glucan
1.7: Sự gắn ơ-agglutinin trên thành tế bào [51-52]. 2.3. Nguyên tắc của công nghệ bê mặt tế bào nấm men
Elocculin, protein mã hóa bởi gen FLO7, các protein trên thành tế bào Cwp (cell wall protein) và a, œ-agglutinin được sử dụng để cố định protein ngoại lai lên
bể mặt tế bào nấm men. Trong đó, các thông tin về œ-agglutinin và protein Aga2 được hiểu rõ ràng nhằm mục đích biểu hiện protein trên bể mặt ngoài cùng của tế
bào.
Trang 25
Ở trường hợp Aga2, đầu C của protein ngoại lai được nối với đầu N của Aga2 như trên Hình 1.7B. Phức hệ protein này nối với Agal bằng cầu nối disulfide. Protein mục tiêu được chuyển vị qua màng và cố định trên bể mặt tế bào nhờ trình tự nhận biết của Aga2p.
Hình 1.8: Biểu hiện protein ngoại lai lên bề mặt tế bào sử dụng nửa đầu C của œ- agglutinin và a-agglutinin [51-52].
Trong trường hợp sử dụng œ-agglutinin để cố định protein ngoại lai trên bể mặt tế bào nấm men. Protein mục tiêu được nối với vùng tín hiệu gắn neo GPI gắn ở đầu C -œ-agglutinin bằng kỹ thuật gen như Hình 1.7A. Đầu C của œ-agglutinin (CH-Agơp) là trình tự gồm 320 amino acid nằm ở đầu C của œ-agplutinin chứa trình tự gắn neo GPI. Cấu trúc neo GPI được sử dụng để nhận biết và chuyển vị protein mục tiêu lên bể mặt tế bào.
Trình tự tiết đặc hiệu Trình tự tín hiệu gắn neo GPI Promoter
Gen cần biểu hiên Nửa phần 3' của gen o-agglutinin
Đầu C của u-agglutinin
Hình 1.9: Phức hệ gen biểu hiện protein ngoại lai bằng đ-agglutinin (A) và — phức hệ protein biểu hiện trên bê mặt tế bào nấm men (B) [51-52].
2.4. Ứng dụng của công nghệ tế bào nấm men 2.4.1. Cố định enzym đ-galactosidase
œ-Galactosidase từ hạt Cyamopsis !etragonoloba, có chức năng giống như một enzym chỉ thị, là enzym ngoại lai đầu tiên định vị trên thành tế bào nấm men Š. cerevisiae ở dạng hoạt động. Trình tự tín hiệu của invertase được gắn với gen mã hóa œ-galactosidase và phức hợp này gắn với gen mã hóa nửa đầu C của d- agglutinn dưới sự kiểm soát của promoter cấu thành của nấm men là phosphoglycerokinase (PGK) [Š 1].
2.4.2. Cố định enzym glucoamylase, œ-amylase, CM-cellulase
Theo qui trình truyền thống, việc tạo ethanol từ tỉnh bột phải theo các bước: (1) nguyên liệu thô được nấu chín ở 140- 180C, (i) sự thủy phân tỉnh bột thành
Trang 27
đường và (1¡) lên men rượu. Mội số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm phát triển
hệ thống lên men sử dụng tế bào nấm men $. cerevisiae tái tổ hợp tiết enzym
glucoamylase ngoại bào (Tubb, 1986), hoặc tế bào nấm men tái tổ hợp biểu hiện enzym glucoamylase trên bể mặt tế bào có khả năng đường hóa tỉnh bột và đẳng hóa sản phẩm glucose để sinh trưởng và lên men [51]. Các nghiên cứu cố định đồng thời hai cnzym giucoamylase từ & oøorzae và œ-amylase từ Bacilus stearothermophilus C21 (BSTA) lên bề mặt tế bào nấm men Š. cerevisiae cho thấy tế bào nấm men tái tổ hợp này biểu hiện được cả hai enzym lên bể mặt tế bào, có khả năng sinh trưởng và lên men trực tiếp từ tính bột. Ngoài tỉnh bột, cellulose là nguồn carbohydrate lớn trong sinh quyển. Trong hướng lâu dài giải quyết vấn để tài nguyên năng lượng, hóa học, thực phẩm, cellulose là nguồn tài nguyên tái sinh hứa hẹn nhất lại có trứ lượng lớn. Tuy nhiên, tế bào nấm men Š. cerevisiae không thể sử dụng vật liệu cellulose mặc dù nó rất đa đụng trong công nghiệp lên men. Enzym carboxymethylcellulase (CM-cellulase) từ AspergHlus aculeatus phân cắt nốt B-1,4- glycoside của celulose đã được chọn để biểu hiện trên bể mặt tế bào. Các dòng tế bào tái tổ hợp chứa vector biểu hiện cấu thành bởi phức hợp gen mã hóa cho các enzym và gen mã hóa đầu C của œ-agglutinin đặt dưới sự điều khiển của promolter GAPDH [29-33,51].
2.4.3. Cố định protein phát quang lục (GEP)
Chỉ thị nhìn thấy được cố định trên bể mặt tế bào là rất quan trọng trong nghiên cứu sự tương tác giữa tế bào và môi trường. So sánh với chỉ thị kiểu enzym, chỉ thị nhìn thấy là một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu phiên mã gen, định vị protein trên màng... Hệ thống chỉ thị quang học mới này đã được nghiên cứu, thiết
Tổng quan tài liệu
kế biểu hiện gen GFEP và AEQ từ sứa Aeguorea victoria lên bễ mặt tế bào nấm men S. cerevisiae [2,44].
2.4.4. Biểu hiện thư viện peptide
Thư viện peptide và protein đã được biểu hiện thành công trên bể mặt tế bào nấm men bằng cách sử dụng hệ thống gắn vào đầu C vào gen Aga2p (Hình 1.8). Thư viện các kháng thể sợi đơn Fv biểu hiện trên bể mặt đã được sàng lọc (Hình 1.9). Ngoài ra, việc biểu hiện trên bể mặt tế bào nấm men một số phân tử khác
tương tự như kháng thể (ví dụ như tế bào nhận scT) đã được thực hiện sau khi đột
biến vùng thay đổi đặc hiệu. Tế bào nấm men biểu hiện các thể scT đột biến, có
khả năng bám đặc hiệu với kháng nguyên peptide MHC, đã được chọn lọc từ thư
viện [20,28]. k7” T¬“‹ ⁄⁄ ⁄ / PIuoneeennt an Tế bào nấm men ⁄ ; 9 CỐ. bà /
Hình 1.10: Biểu hiện thư viện scFV trên bê mặt tế bào nấm men [14.21]
Tổng quan tài liệu
Trang 29 tr. `⁄ 4 4 4 ï— TƯỞNG ở XU 4 4 “ựm-œ--Ầ `). "¬ ị p.——` >^-:“ Jˆ,Ó Nhuộm kháng nguyên
Nhằm” si Y A (đánh dấu huỳnh quang)
Vector biểu hiện bể củ b. XƯNG th
mặt với thư viện đột biến ` & CÁN HA —— vờ „4 "`
=Ỉ »- 44
tế bào nấm men biểu hiện tr ý*“ˆw
thư viện @ồ ˆ Chọn dòng tế bào bằng flowcyomeu =- ⁄4 # of Fusions Nhân dòng được chọn Adq binding Dòng được chọn
Hình 1.11: Sàng lọc thư viện các scFv bằng kỹ thuật flow cytometry [14]
3. Hệ thống biểu hiện gen ở tế bào nấm men Saccharornyces cerewisiae
Š. cerevisiae có rất nhiều đặc điểm thích hợp cho việc sử dụng chúng như là
phương tiện để biểu hiện gen ngoại lai trong nghiên cứu, công nghiệp, y dược. Sinh hóa học và di truyễển học của nấm men Š. cerevisiae được hiểu cặn kẽ. Trải qua một lịch sử ứng dụng lâu đài trong lên men rượu bia truyền thống và qua một thế kỷ sử dụng trong công nghiệp, nấm men và những sản phẩm lên men của nó được chấp
nhận một cách rộng rãi và rất an toàn. Nấm men Š. cerevisiae là vi sinh vật không
gây bệnh cho người và không tạo nội độc tố. So với tế bào hữu nhũ, tế bào nấm men sinh trưởng tương đối nhanh (thời gian nhân đôi là 90 phút) trên môi trường đơn giản cho ra mật độ tế bào cao [38,48].
Nguyên lý cơ bản của việc biểu hiện một protein ngoại lai trong một hệ thống tế bào chú bao gồm hai bước. Bước đầu tiên là việc đưa gen ngoại lai vào tế
bào chủ gầm ba phần: a) xác định và phân lập DNA mục tiêu, b) chọn vector và
cấu trúc vector tái tổ hợp, c) chọn và cấu trúc hệ thống biểu hiện thích hợp trong tế bào chú. Bước thứ hai là kiểm soát các nhân tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của DNA ngoại lai để biểu hiện với hiệu quả tốt nhất trong tế bào đã chọn, DNA hiện điện trong tế bào chủ ở dạng plasmid, có khả năng tự sao chép độc lập hoặc gắn vào bộ gen tế bào chú, Thể biến nạp đễ dàng sàng lọc nhờ có sự hiện diện của gen chọn lọc trong plasmid [35].
Khi đưa gen ngoại lai vào tế bào chủ nấm men, điều cần thiết là phải xem xét hiệu quả biểu hiện của gen này. Ban đầu, người ta sử dụng promoter của chính gen đó để xem hiệu quả dịch mã. Tuy nhiên, không lâu sau này người ta thấy rằng dùng proroter của chính gen đó cho hiệu quả dịch mã không cao, cần thiết phải sử dụng promoter của nấm men. Thêm vào đó, hầu hết các gen ở tế bào nhân thực bậc cao chứa những trình tự intron, các trình tự này sẽ không được xử lý ở trong tế bào nấm men, vì vậy phải tạo gen mã hóa protein ngoại lai của tế bào nhân thực ở dạng cDNA hơn là ở dạng DNA bộ gen [38].
Nấm men có thể thực hiện các biến đổi protein sau địch mã, glycosy! hóa và tiết protein ra ngoài tế bào. Điều kiện thuận tiện trên đã khuyến khích nghiên cứu sâu hơn về quá trình tiết protein ngoại lai ở nấm men, Điều này được quan (âm vì giúp đễ thu nhận và tỉnh sạch protein hơn. Ngoài ra, một vấn đề quan trọng khác là protein tái tổ hợp được tạo thành cần có cấu trúc gấp khúc đúng.
Tổng quan tài liệu
Trang 31
Để gen ngoại lai được biểu hiện tốt trong tế bào chú, người ta phải tạo ra một phức hợp gen đồng khung dịch mã nằm giữa gen cấu trúc và promoter. Phức hợp gen này nằm trong plasmid biểu hiện. Để chèn gen vào plasmid biểu hiện, các vị trí cắt hạn chế duy nhất được đưa vào định vị ở vùng thượng lưu của promoter và
hạ lưu của nhân tố kết thúc dịch mã [48].
3.1 Biến nạp DNA vào tế bào nấm men
Tế bào nấm men được xử lý để trở nên có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai bằng nhiều phương pháp khác nhau. Một trong những phương pháp là việc dùng enzym phá thành tế bào tạo tế bào trần. DNA được đưa vào trong tế bào nhờ sự tác dụng của ion calclum và polyethylene giycol, Phương pháp này thành công với các tế bào nấm men đơn bội tự dưỡng với các plasmid sát nhập và các plasmid 2um. Phương pháp cho hiệu quả biến nạp cao hơn là phương pháp xử lý với ion lithium, |48].
3.2 Các vector
Có rất nhiều dạng vector được dùng để tạo đồng và biểu hiện gen trong tế bào nấm men bao gồm vector sát nhập (ntegrating vector) vector 24m, vector chứa
trình tự sao chép độc lập (aufonomously replicating sequences- ARSs), vector chứa
trung thể (centromeric), và vector nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).Tất cả các vector sử dụng trong tế bào nấm men thường được thiết kế sao cho sao chép chọn lọc trong cả E. col và §. cerevisiae. Mặt khác, mỗi loại vector lại có các đặc
tính khác nhau tùy thuộc vào mục đích sứ dụng. Nhằm biểu hiện một gen ngoại lai
cho hiệu quả cao thì vector sát nhập và plasmid 2um là hai loại thường được chọn
do tính ổn định đi truyền cao và biểu hiện mạnh. [48].
Tổng quan tài liệu
3.2.1 Vector sát nhập Y Tp (Yeast Imegraling plasmid)
Vector sát nhập có tính bên vững cao, chỉ mất đi 1% qua một thế hệ trong
điều kiện nuôi cấy không cần áp lực chọn lọc. Vector này chứa một trình tự cho phép gắn vector lên nhiễm sắc thể tế bào nấm men, gen chọn lọc ở nấm men và E, coli, một trình tự khởi đầu sao chép ở tế bào vi khuẩn, Sự sát nhập vector vào bộ gen của nấm men có thể xây ra nhờ sự trao đổi chéo đơn giữa vector và nhiễm sắc