Trang 17
2.2.5. Các nghiên củu về di truyền phân tử của aggiutinin từ S. cerevisiae Hai phương pháp tiếp cận đã được dùng để nghiên cứu di truyền phân tử của
aggluunin là phương pháp đi truyền học và phương pháp sinh hóa. Để tiếp cận di truyền học, các nhà khoa học thực hiện tạo các đột biến khiếm khuyết khá năng tiếp hợp của một kiểu tiếp hợp nhất định và đồng hóa gen này. Trong cách tiếp cận sinh hóa học, các nhà khoa học thực hiện tỉnh sạch các agglutinin, thu thông tin về trình tự amino acid, tổng hợp các oligonucleotid đặc trưng cho trình tự nều trên và đùng các oligonueleotid này để nghiên cứu cấu trúc gen apglutinin [25].
2.2.5.1 Gen ơ-agglutinin từ Š. cerevisiae
Gen œ-agglutinin (AGzl) được dòng hóa bằng việc sử dụng dòng đội biến AGza1 làm tế bào chủ và chọn lọc đồng biến nạp chứa đoạn DNA chèn lai được với mẫu đò oligonucleotide được ngoại suy từ trình tự amino acid của AGzi., Gen AGai raã hóa cho một protein có trọng lượng phân tử là 70,5kDa. Mội vài chứng cứ thực nghiệm giúp xác minh rằng gen AGøi mã hóa cho œ-agglutinin. Ví dụ kháng thể kháng œ-agglutinin đã nhận điện được protein tái tổ hợp của AGđl ở E, coli Ngoài ra, kháng thể này được chứng minh là gắn vào trình tự amino acid từ 128 đến 356 của gen AGaœ1. Mặt khác, kháng thể này ức chế quá trình tiếp hợp khi được ủ với tế bào ơ. Ngược lại, sự bổ sung đồng thời AG2! tái tổ hợp và kháng thể thì ngăn cần sự ức chế. Kháng thể kháng protein từ #. coli cũng ức chế quá trình tiếp hợp. Ngoài ra, trình tự pepude tín hiệu của đầu N của œ-aggluũnin được tìm thấy trong khung đọc mở (OREF, open reading frame) của gen AGø! [18,25].
Các khảo sát đặc tính protein dựa trên khung đọc mở của AØø/ cho ra một số hiểu biết thú vị. Đầu C và N của AGøœ1 đều ky nước và có thể để định vị trên bể
mặt tế bào. Trên phân tử có 12 vị trí có thể tạo liên kết N-glyeosyl và hầu hết là nằm bên đầu C. Ser và Thr, các amino acid chứa các vị trí tạo liên kết O-glycosyl chiếm khoảng 29% và cũng nằm ở đầu C, Do vậy có giả thuyết cho rằng đầu C của
protein agglutinin có độ glycosyl hóa cao và là nơi neo vào bề mặt tế bào. Các nhà nghiên cứu cũng cho rằng vùng mang tính axít từ vị trí amino acid 200 đến 300 tương ứng với vùng gắn đặc hiệu, vùng này có lẽ có rất ít hoặc không có các carbohydrate [24].
2.2.3.2 Gen a-agglutinin từ Š. cerevisiae
Các phân tích về di truyền phân tử cho thấy gen GAỚ/ mã hóa cho tiểu phần lõi của a-agelutinin. Khung đọc mở của gen GAG/ mã hóa cho một protein có 725 amino acid. Đầu C và đầu N có tính ky nước. Tảnh tự đầu C chứa phần neo vào bể
mặt tế bào. Nói chung, khung đọc mở chứa 50% Ser và Thr không có chứa các vị trí có thể tạo liên kết glycosyl. Đo vậy, protein này có các carbohydrat gắn liên kết O- glycosyl và không có các carbohydrat gắn liên kết N-giycosyl. Gen GAG2 mã hóa
cho phần gắn của a-agglutinin [43].
2.2.6. Vùng gắn đặc hiệu của œ-agglulinin
Việc nghiên cứu các phức hợp gắn của hai phân tử aggluuinin từ hai tế bào mang kiểu tiếp hợp ngược nhau Ở . wingei, ŠS. kluyver và S. cerevisiae cho thấy rằng các phân tử agglutinin tương tác trực tiếp với nhau. Đặc tính gắn cúa hai loại agglutinin là giống nhau trong điều kiện in vitro và ín vivo. Sự tương tác này theo tỉ lệ 1:1, mỗi a-agglutinin tương tác với một œ-agglutinin. Phân tích về vùng tương tác giữa hai tế bào cho thấy có sự gắn của bai tế bào trên nhiều điểm khác nhau trên bễ ruặt tế bào của cả hai tế bào. Với các tế bào có phân tử aggluunin đơn trị, mỗi
Trang 19
tế bào có thể tương tác với vài tế bào khác bằng nhiều phân tứ aggliutinin, Số vị trí gắn (số agglutinin) trên mỗi tế bào thì thay đổi giữa các loài và các chúng, phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, và được tăng lên do cắm ứng bởi pheromone. Ở $%, cerevisiae, số phân tử a-agglutinin trung bình là 10” trên một tế bào, còn tế bào œ-
agglutinin là 10” đến 10' [24].
Từ đặc điểm của agglutinin có thể đưa ra giả thuyết vùng mang tính axít là vùng gắn của œ-agglutinin, Đoạn có hoạt tính gắn của œ-agglutinin từ H. wingei và ÐP. ametionina là vùng có tính axit. Giá trị pH tối thích cho sự kết hợp ở H. wingei và Š. cerevisiae Ö trong khoảng pH 4,5 đến 6,5. Vì vậy, người ta cho rằng vùng mang tính axít từ 200 đến 300 của AGal tạo ra íL nhất là môt phần của vị trí gắn. Ngoài ra, các nghiên cứu khác cho thấy việc dùng kháng thể kháng œ-aggiutinin để khóa phần gắn sẽ ức chế quá trình tiếp hợp do đó có thể kết luận phần gắn nằm trong khoảng từ 128 đến 356 của AGøi. Tất cả các sẵn phẩm thủy phân œ agplutinin với endo EF đều có chung trình tự đầu N, và đều bắt đầu từ amino acid 20. Vì vậy có thể kết luận vùng gắn nằm Ở hai phần ba đầu N của protein, Đột biến
khuyết œ-aggluuinin chỉ biểu hiện 351 amino acid đầu tiên của protein œ-agglutinin, cho thấy tế bào này không có khả năng tiếp hợp với tế bào a với ái lực tương đương với tế bào hoang đại. Vùng gắn được để nghị trên đây cũng được tìm thấy ở nhiều
sinh vật nhân thực bậc cao hơn. Trình tự amino acid từ 200 đến 320 của gen AGøi
có đặc điểm giống như globulin miễn dịch loại V [12-13,24].
Đomain l Domain IÏ Đomain fH ct M-giycan —~©-giycan Vách tế bào
Hình 1.4: Cấu trúc của œ-agelutinin[22} 2.2.7. Cơ chế gắn aggiutinin trên bê mặt tế bào
Tế bào nấm men Š. cerevisiae có thành tế bào cứng đầy khoảng 200nm, nằm ngoài lớp màng tế bào chất, chiếm 15 đến 30% trọng lượng khô của tế bào. Thành tế bào %. cerevisiae chú yếu bao gồm các mannoprotein và các nối 8-glucan, có cấu trúc lớp đôi chứa lớp giucan tạo bộ xương bên trong, được tạo thành từ các nối ølucose 8-1,3 và B-1,6 và lớp ngoài hình sợi hoặc hình bó, được tạo thành chú yếu là mannoprotein. Các protein này được gắn vào glucan qua các nối hóa trị, Có hai loại mannoprotein hiện diện trên thành tế bào Š, cerevisiae,. Dạng mannoprotein thứ nhất có phân tử lượng nhỏ, gắn lỏng lẻo trên thành tế bào bởi các nối không hóa trị và có thể được tách ra bằng sodium đodecylsulfate (SDS). Khi xử lý tế bào bằng SDS có khoảng 60 loại protein có khối lượng phân tử thấp tách ra. Dạng manoprotein thứ hai gắn cộng hóa trị với thành khung glucan [23,40].
Tổng quan tài liệu