Hình 1.11: Sàng lọc thư viện các scFv bằng kỹ thuật flow Cy†OmetTV

Trang 17

2.2.5. Các nghiên củu về di truyền phân tử của aggiutinin từ S. cerevisiae

Hai phương pháp tiếp cận đã được dùng để nghiên cứu di truyền phân tử của

aggluunin là phương pháp đi truyền học và phương pháp sinh hóa. Để tiếp cận di truyền học, các nhà khoa học thực hiện tạo các đột biến khiếm khuyết khá năng tiếp hợp của một kiểu tiếp hợp nhất định và đồng hóa gen này. Trong cách tiếp cận sinh hóa học, các nhà khoa học thực hiện tỉnh sạch các agglutinin, thu thông tin về trình tự amino acid, tổng hợp các oligonucleotid đặc trưng cho trình tự nều trên và đùng các oligonueleotid này để nghiên cứu cấu trúc gen apglutinin [25].

2.2.5.1 Gen ơ-agglutinin từ Š. cerevisiae

Gen œ-agglutinin (AGzl) được dòng hóa bằng việc sử dụng dòng đội biến AGza1 làm tế bào chủ và chọn lọc đồng biến nạp chứa đoạn DNA chèn lai được với mẫu đò oligonucleotide được ngoại suy từ trình tự amino acid của AGzi., Gen AGai raã hóa cho một protein có trọng lượng phân tử là 70,5kDa. Mội vài chứng cứ thực nghiệm giúp xác minh rằng gen AGøi mã hóa cho œ-agglutinin. Ví dụ kháng thể kháng œ-agglutinin đã nhận điện được protein tái tổ hợp của AGđl ở E, coli Ngoài ra, kháng thể này được chứng minh là gắn vào trình tự amino acid từ 128 đến 356 của gen AGaœ1. Mặt khác, kháng thể này ức chế quá trình tiếp hợp khi được ủ với tế bào ơ. Ngược lại, sự bổ sung đồng thời AG2! tái tổ hợp và kháng thể thì ngăn cần sự ức chế. Kháng thể kháng protein từ #. coli cũng ức chế quá trình tiếp hợp. Ngoài ra, trình tự pepude tín hiệu của đầu N của œ-aggluũnin được tìm thấy trong khung đọc mở (OREF, open reading frame) của gen AGø! [18,25].

Các khảo sát đặc tính protein dựa trên khung đọc mở của AØø/ cho ra một số hiểu biết thú vị. Đầu C và N của AGøœ1 đều ky nước và có thể để định vị trên bể

mặt tế bào. Trên phân tử có 12 vị trí có thể tạo liên kết N-glyeosyl và hầu hết là

nằm bên đầu C. Ser và Thr, các amino acid chứa các vị trí tạo liên kết O-glycosyl

chiếm khoảng 29% và cũng nằm ở đầu C, Do vậy có giả thuyết cho rằng đầu C của

protein agglutinin có độ glycosyl hóa cao và là nơi neo vào bề mặt tế bào. Các nhà nghiên cứu cũng cho rằng vùng mang tính axít từ vị trí amino acid 200 đến 300 tương ứng với vùng gắn đặc hiệu, vùng này có lẽ có rất ít hoặc không có các carbohydrate [24].

2.2.3.2 Gen a-agglutinin từ Š. cerevisiae

Các phân tích về di truyền phân tử cho thấy gen GAỚ/ mã hóa cho tiểu phần

amino acid. Đầu C và đầu N có tính ky nước. Tảnh tự đầu C chứa phần neo vào bể

mặt tế bào. Nói chung, khung đọc mở chứa 50% Ser và Thr không có chứa các vị trí có thể tạo liên kết glycosyl. Đo vậy, protein này có các carbohydrat gắn liên kết O- glycosyl và không có các carbohydrat gắn liên kết N-giycosyl. Gen GAG2 mã hóa

cho phần gắn của a-agglutinin [43].

2.2.6. Vùng gắn đặc hiệu của œ-agglulinin

Việc nghiên cứu các phức hợp gắn của hai phân tử aggluuinin từ hai tế bào mang kiểu tiếp hợp ngược nhau Ở . wingei, ŠS. kluyver và S. cerevisiae cho thấy rằng các phân tử agglutinin tương tác trực tiếp với nhau. Đặc tính gắn cúa hai loại agglutinin là giống nhau trong điều kiện in vitro và ín vivo. Sự tương tác này theo tỉ lệ 1:1, mỗi a-agglutinin tương tác với một œ-agglutinin. Phân tích về vùng tương tác giữa hai tế bào cho thấy có sự gắn của bai tế bào trên nhiều điểm khác nhau trên bễ ruặt tế bào của cả hai tế bào. Với các tế bào có phân tử aggluunin đơn trị, mỗi

Trang 19

tế bào có thể tương tác với vài tế bào khác bằng nhiều phân tứ aggliutinin, Số vị trí

gắn (số agglutinin) trên mỗi tế bào thì thay đổi giữa các loài và các chúng, phụ

thuộc vào điều kiện nuôi cấy, và được tăng lên do cắm ứng bởi pheromone. Ở $%,

agglutinin là 10” đến 10' [24].

Từ đặc điểm của agglutinin có thể đưa ra giả thuyết vùng mang tính axít là vùng gắn của œ-agglutinin, Đoạn có hoạt tính gắn của œ-agglutinin từ H. wingei và ÐP. ametionina là vùng có tính axit. Giá trị pH tối thích cho sự kết hợp ở H. wingei và Š. cerevisiae Ö trong khoảng pH 4,5 đến 6,5. Vì vậy, người ta cho rằng vùng mang tính axít từ 200 đến 300 của AGal tạo ra íL nhất là môt phần của vị trí gắn.

Ngoài ra, các nghiên cứu khác cho thấy việc dùng kháng thể kháng œ-aggiutinin để

agplutinin với endo EF đều có chung trình tự đầu N, và đều bắt đầu từ amino acid 20.

Vì vậy có thể kết luận vùng gắn nằm Ở hai phần ba đầu N của protein, Đột biến

khuyết œ-aggluuinin chỉ biểu hiện 351 amino acid đầu tiên của protein œ-agglutinin, cho thấy tế bào này không có khả năng tiếp hợp với tế bào a với ái lực tương đương với tế bào hoang đại. Vùng gắn được để nghị trên đây cũng được tìm thấy ở nhiều

sinh vật nhân thực bậc cao hơn. Trình tự amino acid từ 200 đến 320 của gen AGøi

có đặc điểm giống như globulin miễn dịch loại V [12-13,24].

Hình 1.4: Cấu trúc của œ-agelutinin[22}

2.2.7. Cơ chế gắn aggiutinin trên bê mặt tế bào

Tế bào nấm men Š. cerevisiae có thành tế bào cứng đầy khoảng 200nm, nằm

ngoài lớp màng tế bào chất, chiếm 15 đến 30% trọng lượng khô của tế bào. Thành

Tổng quan tài liệu