2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin
Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu ựỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa ựỏ và xanh (thành màu tắm), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật. đây là chất màu có rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới. Anthocyanin là glycosid của các anthocyanidin với monosaccharide, di và trisaccharide. Anthocyanidin ắt tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên. Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium. Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ
biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau do ựộ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B.
Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin
2.4.2 Tắnh chất của anthocyannin
Màu của anthocyanin ựược xác ựịnh bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài. Có thể
hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lại cho màu khác nhau.
Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử sẽ làm cho nó chuyển từ màu ựỏ sang màu xanh (blue). Khi thay nhóm hydroxyl bằng nhóm methoxyl sẽ làm ngược lại khuynh hướng ựổi màu. pH thấp anthocyanin thường có màu ựỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa. Sự biến ựổi dạng anthocyanin theo pH:
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng ựến anthocyanin
+ Nhiệt ựộ: khi tăng nhiệt ựộ sẽ dẫn ựến sự thay ựổi ựộ hấp thu cực ựại, màu của anthocyanin cũng giảm khi gia tăng nhiệt ựộ
+ pH: pH quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn ựến sự thoái hóa màu anthocyanin, hiệu quả của chất màu này ựạt cực ựại ở pH 3,5
+ Thời gian bảo quản và ánh sáng: tăng thời gian bảo quản thì chất màu anthocyanin giảm và khi bảo quản ở các ựiều kiện môi trường khác nhau cũng ảnh hưởng ựến sắc tố
anthocyanin. Thời gian bảo quản và chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên sự ổn ựịnh của anthocyanin. Các nhà nghiên cứu ựã cho rằng giữ mẫu ngoài ánh sáng thì nồng ựộ của chất màu giảm mạnh hơn trong tối.
+ Các yếu tố khác cũng có thểảnh hưởng ựến màu anthocyanin như nồng ựộ của các chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương ựối trong hỗn hợp các anthocyanin, ảnh hưởng của các sắc tố khác như carotenoid, chlorophyll.
2.5 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU
Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại này ựòi hỏi cần phải có oxy. Vi khuẩn acetic cần có oxi ựể phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong ựiều kiện hàm lượng oxy thấp. Trong nước quả, ngoài nấm men còn có nhiều loại vi khuẩn, vi khuẩn khó nghiên cứu hơn men vì kắch thước nhỏ hơn men nhiều. Chỉ gần ựây nhờ có kắnh hiển vi ựiện tử mới biết rõ thêm về cấu
khuẩn thì tác ựộng ựến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại như vi khuẩn xêrin làm cho rượu có vị chua, vịựắng, có mùi hôi Ầ
2.5.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic
Rượu vang ựể tiếp xúc rộng rãi với không khắ chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ ựó là màng giấm. Khuẩn giấm biến cồn êtylic thành acid acetic, do ựó rượu vang có mùi giấm. Một phần nhỏ acid acetic lại hợp với cồn êtylic thành một este, ethyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm. Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi etyl acetate
ựểựánh giá rượu co bị chua giấm hay không. Phản ứng tạo thành giấm
C2H5OH + O2 = CH3COOH + H2O
Tuy nhiên, Peynaud cho rằng mùi chua giấm là do ethyl acetate, một este ựược hình thành bởi vi khuẩn acetic
C2H5OH + CH3COOH = CH3COOC2H5 + H2O
Một số vi khuẩn lên men giấm sản xuất ra nhiều etyl acetate hơn những sản phẩm khác, etyl acetate có thể bị mất do sự bay hơi trước khi lên men và hòa vào trong rượu.
Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau ựây:
- Số lượng khuẩn ban ựầu, do ựó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh ựể giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn
- Nhiệt ựộảnh hưởng lớn, thắ dụ lượng acid acetic hình thành ở 280C cao gấp ựôi ở 230C. - độ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua khuẩn giấm càng khó sinh sản, thắ dụ dưới pH 3,2 rất ắt khi thấy xuất hiện khuẩn giấm.
- Polyphenol - tanin có tác dụng kìm hãm (nhẹ).
- Các vitamin ảnh hưởng cũng nhưựối với khuẩn lactic, cần thiết nhất là acid pantothenic, nicotinamic, acid - amino benzoic ựôi khi thiamin (B1).
- Khuẩn giấm cần rất nhiều oxy. Thắ dụ muốn tăng acid bay hơi 0,8 g trong một lắt rượu vang, khuẩn phải có tối thiểu 2 lắt không khi. Vậy giữ rượu vang trong chai, lọ nút kắn, không cho tiếp xúc với không khi là cách tốt nhất ựể chống bệnh chua giấm.
Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng ựến hoạt ựộng của men giấm nên mặc dù có khuẩn nhưng không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm
2.5.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic
2.5.2.1 Sinh thái khuẩn lactic
Loại vi khuẩn này có thể hiện diện ở bất cứ nơi ựâu như trên nguyên liệu, trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có. Không phải tất cả các vi khuẩn này ựều có thể tồn tại: một số không thể sinh sản ựược vì pH quá thấp, có ựộ cồn tăng lên dần thì vi khuẩn bị
sau này gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thắch ứng ựược dần dần với ựiều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh. Cần chú ý là trong quá trình lên men, ựiều kiện không thuận cho vi khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các nấm men với số lượng lớn. Tế bào nấm men ựông hơn, thắch hợp với cồn, với pH thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của vi khuẩn, và khi cho thêm SO2 vào lại thuận cho nấm men hơn là cho vi khuẩn vì nấm men chịu ựựng giỏi hơn. Như
vậy, lên men malôlactic bắt ựầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kìm hãm dần lại và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết quả của sự thắch nghi dần của một số tế bào vi khuẩn giỏi chịu ựựng.
2.5.2.2 Hoạt ựộng của vi khuẩn lactic
Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên: ngay những giờựầu sự lên men lactic bắt ựầu nhưng sau ựó ngừng lại vì vi khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế. Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ắt vi khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10000 vi khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy ựáng kể. Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày ựến vài tuần lễ, số lượng vi khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malôlactic mới bắt ựầu. Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng vi khuẩn lactic lại giảm.
Các yếu tốảnh hưởng ựến vi khuẩn lactic
- độ pH có ảnh hưởng lớn, pH thắch hợp cho vi khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ởựộ pH này, vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy không phải acid malic mà là ựường, acid tatric... làm hỏng rượu. Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì vi khuẩn hoạt ựộng rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số khuẩn cầu (Leuconostoc).
- Nhiệt ựộ tác ựộng ựến vi khuẩn cũng giống như ựối với nấm men, thắch hợp nhất là vào khoảng 25-300C. Tuy nhiên, nhiệt lên tới 300C khi lượng cồn etylic ựã cao thì vi khuẩn lactic có thể bị diệt. Vì vậy, khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250C thắch hợp.
- Yêu cầu ựối với oxy: người ta thường cho vi khuẩn lactic yếm khắ, trái với vi khuẩn giấm háo khắ. Thực ra vi khuẩn lactic có thể chịu ựược yếm khắ nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt ựộng có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khắ.
- Yêu cầu ựối với acid amin: mỗi loài vi khuẩn có những yêu cầu nhất ựịnh ựối với từng loại acid amin; yêu cầu của vi khuẩn cầu cao hơn vi khuẩn que về mặt này.
- Yêu cầu ựối với cac vitamin: cũng như nấm men, vi khuẩn cần có những vitamin nhất
ựịnh ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của vi khuẩn que lại cao hơn vi khuẩn cầu. Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho ựa số vi khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và ựôi khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tinh chất kắch thắch tùy theo loại vi khuẩn.
2.5.2.3 Kết quả hoạt ựộng của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu
thức có 2 nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có một nhóm COOH, một chức acid; nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm ựộ chua ựược một nửa, rượu dịu ựi, ngoài ra acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn.
Lên men malolactic không cung cấp năng lượng cho vi khuẩn lactic cho nên vi khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu ựể lấy năng lượng. Vì vậy, không có vi khuẩn lactic nào hoàn toàn có ắch cả. Thực ra người ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn lactic: một nhóm bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành phần khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, một nhóm thứ hai thường chỉ quen phân hủy acid malic và là khuẩn có ắch và chỉ có hại trong những ựiều kiện ựặc biệt.
Trong quá trình chế biến rượu, khi theo dõi lên men rượu, ựồng thời cũng phải theo dõi lên men malolactic. Phải phân tắch ựịnh kỳ ựều ựặn ựộ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic. Khi nào hết acid malic thì gạn cặn, lọc ựể loại bớt vi khuẩn -nếu cần tiệt trùng. - Bệnh rượu vang: Chỉ có lên men malolactic là tăng chất lượng của vang, những biến ựổi khác do vi khuẩn lactic gây ra ựều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh.
Bệnh vang dắnh (vins filants): khi rót rượu ra cốc vang không chảy ựều, lỏng như nước mà dắnh như có hồ nếp. đó là do vi khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những ựiều kiện nhất ựịnh, tiết ra quanh mình một loại ựường riêng gọi là dextran. Bệnh nay thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang ựắng..
Bệnh chua lactic (piqure lactique): xảy ra khi trong rượu vang còn lại ựường khử, chưa chuyển hết thành rượu. đường khử bị vi khuẩn lactic phá hủy chuyển thành ựường manic và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu. Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều ựường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho men ngừng hoạt ựộng nửa chừng hoặc do cấy men chưa ựủ, lượng nhiệt quá cao.
Bệnh chua tatric (tourne): xảy ra khi vi khuẩn lactic phá hủy acid tatric làm cho rượu ựục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt...Chỉ khi pH cao hơn 3,5-3,6 mới có bệnh này vì vậy rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh.
Bệnh ựắng: Xảy ra khi men lactic phá hủy glycerin. Rượu trở thành chua, có vị ựắng do các chất acrolêin hình thành.
CHƯƠNG III Ờ PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 PHƯƠNG TIỆN
Thắ nghiệm ựược tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường đại học Cần Thơ.
3.1.1 Nguyên liệu
Gạo nếp than (Mua tại cửa hàng gạo số 2, chợ Xuân Khánh, Cần Thơ) Nấm men thuần chủng: Saccharomyces cerevisiae (nấm men Pháp) Enzyme α-amylase (Termamyl 120L)
Enzyme glucoamylase (AMG 300L)
đường saccharose (Sử dụng ựường Biên Hòa mua tại Metro).
3.1.2 Hóa chất sử dụng
Acid citric
Acid sorbic
Muối Ca2+
Các hóa chất sử dụng ựể chuẩn ựộ acid, aldehyde, ester, methanol.
3.1.3 Trang thiết bị
Thiết bịựường hóa và dịch hóa nếp than Máy nghiền búa
Cồn kế
Máy ựo màu quang phổ
Nhiệt kế, máy ựo pH
Một số kiệu lớn làm dụng cụ chứa trong quá trình bảo quản.
Cân ựiện tử và một số dụng cụ thông thường của phòng thắ nghiệm.
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1 Thắ nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng ựộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ựến hàm lượng ựường khử và ựộ Brix của dịch ựường trong quá (AMG 300L) ựến hàm lượng ựường khử và ựộ Brix của dịch ựường trong quá trình ựường hóa
Mục ựắch: Tìm ra nồng ựộ enzyme tối ưu cho quá trình ựường hóa.
Bố trắ thắ nghiệm: Thắ nghiệm ựược bố trắ ngẫu nhiên với một nhân tố là nồng ựộ enzyme glucoamylase và số lần lặp lại thắ nghiệm là 2 lần.
Tổng sốựơn vị thắ nghiệm: 5x2=10 Sơựồ bố trắ thắ nghiệm như sau
Cách tiến hành
Nếp than ựược nghiềm mịn sau ựó cho nước vào với tỉ lệ 1 nếp và 4 nước.
Sử dụng enzyme α-amylase (Termamyl 120L) ựể dịch hóa nếp than với nồng ựộ 0,05 % bổ
sung 70 ppm Ca2+, thời gian 30 phút, ở nhiệt ựộ 860C và pH 6,6.
Sử dụng enzyme glucoamylase với các nồng ựộ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 và 0,6% ta tiến hành
ựường hóa dịch nếp trong thời gian 30 phút ở nhiệt ựộ 690C và pH 4,0.
Ghi nhận kết quả hàm lượng ựường khử và ựộ Brix của sản phẩm sau quá trình ựường hóa.
3.2.2 Thắ nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ựến thời gian lên men chắnh và chất lượng rượu sau quá trình lên men
Mục ựắch: Nhằm tìm ra tỉ lệ nấm men tối ưu cho quá trình lên men.
Bố trắ thắ nghiệm: Thắ nghiệm ựược bố trắ ngẫu nhiên với một nhân tố là tỉ lệ nấm men và 2 lần lặp lại.
Nhân tố B: Tỉ lệ nấm men sử dụng (%) B1=0,06%; B2=0,08%; B3=0,10%; B4=0,12%
Tổng sốựơn vị thắ nghiệm: 4x2=8 Sơựồ bố trắ thắ nghiệm
Pha nước (tỉ lệ nếp 1: nước 4)
Dịch hóa
(0,05% Termamyl 120L, 70ppm Ca2+, thời gian 30 phút, nhiệt ựộ 860C, pH 6,6)
đường hóa
(thời gian 30 phút, nhiệt ựộ 690C, pH 4,0) Gạo nếp than nghiền mịn
A1=0,2(%) A2=0,3(%) A3=0,4(%) A4=0,5(%) A5=0,6(%)
Cách tiến hành
Sau khi tìm ra ựược mẫu enzyme tối ưu cho quá trình ựường hóa ta lấy mẫu sau ựường hóa lọc bỏ bã nếp, thu dịch trong. điều chỉnh dịch ựường lên 220Bx và chỉnh pH ựạt 4,5-5,0. Thanh trùng dịch ựường ở 80-850C trong vòng 30 phút, sau ựó làm nguội xuống 30-330C, cho nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần chủng vào ở những tỉ lệ khảo sát và tiến hành lên men ởựiều kiện lên men yếm khắ.
Kiểm tra ựộ rượu, ựộ trong, lượng tạp chất của từng sản phẩm và thời gian kết thúc quá trình lên men chắnh từựó tìm ra ựược nồng ựộ enzyme tối ưu.
Pha nước (tỉ lệ nếp 1: nước 4)
Dịch hóa
(0,05% Termamyl 120L, 70ppm Ca2+, thời gian 30 phút, nhiệt ựộ 860C, pH 6,6)
đường hóa
(Nồng ựộ enzyme AMG 300L tối ưu, thời gian 30 phút, nhiệt ựộ 690C, pH 4,0) Gạo nếp than nghiền mịn B1=0,2(%) B2=0,3(%) B3=0,4(%) B4=0,5(%) Lọc bỏ bã nếp điều chỉnh pH (4,5-5,0) và ựộ Brix =22o Thanh trùng Làm nguội (30-330C)
Bổ sung nấm men (theo các tỉ lệ như sau)
3.2.3 Thắ nghiệm 3: Khảo sát một số thay ựổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm
Mục ựắch thắ nghiệm: Rượu sẽựược bảo quản trong kiệu sành lớn và ở nhiệt ựộ phòng thắ nghiệm cùng với việc sử dụng chất bảo quản là acid sorbic. Mục ựắch của thắ nghiệm này là ta sẽ khảo sát một số thay ựổi xảy ra trong thời gian bảo quản sản phẩm. Những thay ựổi chủ yếu ựược khảo sát trong thắ nghiệm là: thay ựổi ựộ rượu, ựộ trong, lượng tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản rượu như lượng acid, ester, aldehyde, methanol, fufurol.