Nghiên cứu ký sinh trùng dựa theo phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng của Viện sỹ V.A. Dogiel (1929), có sự bổ sung của TS. Hà Ký và TS. Bùi Quang Tề, 2007 cho phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam.
Sơ đồ nghiên cứu ký sinh trùng
* Công thức tính cường độ nhiễm, tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng:
Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100
Cường độ nhiễm =
4.1. Phương pháp thu mẫu
Kiểm tra ngẫu nhiên cá Chép hương, giống ở khu vực Gia Lâm - Hà Nội và khu vực Từ Sơn – Bắc Ninh. Đặc biệt chú ý đến các vùng thường xuyên xuất hiện bệnh. Nếu mẫu kiểm tra bị nhiễm ngoại ký sinh trùng thì tiến hành thu mẫu cá để làm thí nghiệm. Đối với mẫu đối chứng, lấy mẫu cá không bị bệnh ở cùng lứa tuổi.
Phương pháp thu mẫu cá, kiểm tra ngoại ký sinh trùng của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) và phương pháp đo, cân trọng lượng cá, tính tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm.
Thu mẫu Quan sát
mẫu Làm tiêu bản Phân loại Xác định giống loài Soi tươi Tổng số cá bị nhiễm Tổng số cá kiểm tra
Tổng số lượng ấu trùng đếm được trên cá Tổng số cá bị nhiễm
4.2. Phương pháp quan sát mẫu tươi
Các bước tiến hành:
- Cân khối lượng, đo kích thước từng cá thể cá và ghi chép
- Quan sát bằng mắt thường toàn bộ cơ thể bên ngoài của cá nhằm phát hiện các biểu hiện khác thường của cá như: sự biến đổi mầu sắc, lở loét, những đốm của trùng quả dưa, thích bào tử trùng…
- Đối với cá có kích thước nhỏ (≤ 3 cm) đặt cả con lên lam kính, sau đó nhỏ một giọt nước lên, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại từ nhỏ đến lớn (4 x 10; 10 x 10)
- Đối với cá có kích thước > 3 cm trở lên, cạo nhớt ở các phần khác nhau trên cơ thể cá (da, mang, các vây, đuôi). Sau đó đưa nhớt lên lam kính, nhỏ 1 giọt nước sinh lý, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại từ nhỏ đến lớn (4 x 10; 10 x 10; 10 x 40)
4.3. Cố định, bảo quản và làm tiêu bản ký sinh trùng
Do điều kiện về thời gian, hóa chất cũng như phương pháp kỹ thuật có hạn, chúng tôi chỉ tiến hành cố định, bảo quản và làm tiêu bản đối với trùng bánh xe.
4.3.1. Cố định và bảo quản mẫu
Cố định mẫu bằng cách phết kính: dùng lamen đặt lên trên lam kính ở vị trí có mẫu, kéo ngược lamen về phía sau sao cho nhớt có thể dàn đều một lớp mỏng rồi để khô tự nhiên trong không khí. Xếp mẫu trong các hộp có lót lớp giấy để bảo quản.
4.3.2. Nhuộm và làm tiêu bản ký sinh trùng
Đối với trùng bánh xe, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bằng AgNO3 2% : Các lamen có mẫu đã giữ khô, xếp vào đĩa peptri có mặt trùng ngửa lên trên. Dùng pipet nhỏ dung dịch AgNO3 2% lên chỗ phết mẫu, đậy nắp đĩa peptri để tất cả vào buồng tối trong thời gian từ 10 – 15 phút, lấy ra rửa qua nước cất 3 – 4 lần. Tất cả các kính sau khi rửa chuyển sang đĩa nước
cất khác để mặt có trùng hướng lên trên, đem phơi dưới ánh sáng mạnh của mặt trời trong thời gian từ 15 – 30 phút hoặc hơn phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Trong quá trình nhuộm phải kiểm tra sự bắt màu của tiêu bản nhuộm. Nếu quan sát thấy rõ các cơ quan của trùng thì ngừng phơi. Rửa lại mẫu trong nước cất, để khô tự nhiên trong không khí, gắn tiêu bản bằng nhựa canada và ghi nhãn cho mỗi mẫu.
4.4. Phân loại ký sinh trùng
Dựa vào hình thái, cấu tạo ký sinh trùng, quan sát trùng sống và trùng đã cố định, nhuộm màu, vẽ và chụp ảnh. Từ đó so sánh, phân loại theo các tài liệu phân loại ký sinh trùng đã có.
Tài liệu phân loại:
Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam của Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007;
Sán lá đơn chủ (Monogenea) ở cá của Bukhopski, 1957; Ký sinh trùng đơn bào của Lom và Dykova, 1992;
Monogenea, Trematoda, Nematoda, Crustacea ký sinh ở cá của Yamaguti, 1958, 1960, 1963, 1971.
4.5. Phương pháp xử lý hóa chất với ngoại ký sinh trùng trên cá ChépBảng 3.1. Các nồng độ thuốc và hoá chất dùng để điều trị thử nghiệm ký Bảng 3.1. Các nồng độ thuốc và hoá chất dùng để điều trị thử nghiệm ký
sinh trùng trên cá Chép hương và Chép giống
Thuốc, hóa chất và phương pháp dùng Số mẫu kiểm tra (con) Nồng độ thuốc hoá chất xử lý Ghi chú CuSO4 Tắm 30 3 ppm - Khi xử lý bằng phải bật sục khí liên tục, tránh làm cá bị ngạt do thiếu khí. - Phương pháp tắm: tắm cho cá trong thời gian 15–30 phút.
- Phương pháp ngâm: ngâm cho cá trong thời gian 24 giờ. 30 4 ppm 30 5 ppm Ngâm 30 0,3 ppm 30 0,4 ppm 30 0,5 ppm Formalin Tắm 30 200 ppm 30 250 ppm 30 300 ppm Ngâm 30 20 ppm 30 25 ppm 30 30 ppm KMnO4 Tắm 30 10 ppm 30 15 ppm 30 20 ppm Ngâm 30 1 ppm 30 1,5 ppm 30 2 ppm Muối NaCl: Tắm 30 2% 30 3% 30 4% Ngâm 30 0,2% 30 0,3% 30 0,4%
cm, các bể này được cung cấp nước giếng khoan và sục khí liên tục.
Lô 1: Cá nhiễm ký sinh trùng nuôi trong nước giếng khoan không có hóa chất
Lô 2: Cá nhiễm ký sinh trùng nuôi trong môi nước có pha hóa chất
Cá ở hai lô được nuôi và chăm sóc trong điều kiện giống nhau. Sau thời gian thí nghiệm, dùng vợt bắt cá ra tiến hành làm tiêu bản kiểm tra dưới kính hiển vi. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Lô xử lý hóa chất và lô đối chứng đều được chăm sóc như nhau trong cùng một điều kiện nhiệt độ 25 – 300C, sục khí liên tục. Nước sử dụng để thay hoàn toàn là nước giếng khoan, không dùng nước ao để tránh lây nhiễm các bệnh khác cho cá.
So sánh hiệu quả xử lý của các loại hóa chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau và phương pháp dùng thuốc khác nhau: tắm, ngâm. Các lô thí nghiệm đều là cá nhiễm bệnh được nuôi ở các bể khác nhau (mỗi loại thuốc sẽ được thử nghiệm từ 3 loại nồng độ, tương ứng với 3 bể), sử dụng các loại thuốc, hóa chất khác nhau: Formalin, CuSO4, NaCl, KMnO4 trong cùng một điều kiện để tìm ra loại thuốc, hóa chất và phương pháp xử lý có hiệu quả.
4.6. Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá
- Cường độ nhiễm và tỉ lệ nhiễm từng loại ký sinh trùng trên cá Chép. - Khối lượng và chiều dài của cá Chép trong các lần kiểm tra.
- Kết quả kiểm tra ngoại ký sinh trùng trên cá Chép sau mỗi lần điều trị thử nghiệm.
* Các công thức tính toán
Tính giá trị trung bình: ∑ = = n i i X n X 1 1 Tính độ lệch chuẩn: ( ) n X X S n i i ∑ = − ± = 1 2 Trong đó: X : Giá trị trung bình i X : Số liệu thu lần thứ i n: Số mẫu kiểm tra
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Thành phần giống, loài và CĐN, TLN ngoại ký sinh trùng ký sinh trên cá Chép giai đoạn cá hương và cá giống.
Chúng tôi đã tiến hành thu mẫu cá Chép hương và Chép giống tại khu vực Gia Lâm - Hà Nội và khu vực Từ Sơn – Bắc Ninh. Qua phân tích mẫu cá thu được, chúng tôi đã xác định được các loại ký sinh trùng sau: Trùng bánh xe (Trichodina nobilis Chen, 1963), ấu trùng sán lá song chủ (metacercaria
Centrocestus formosanus Nishigori, 1924), sán lá đơn chủ 16 móc (Dactylogyrus). Trong đó trùng bánh xe Trichodina nobilis được tìm thấy chủ yếu trên da và vây, cường độ nhiễm trên mang xuất hiện ít hơn. Còn ấu trùng sán lá song chủ metacercaria Centrocestus formosanus và sán lá đơn chủ 16 móc Dactylogyrus chủ yếu xuất hiện trên mang.
Bên cạnh đó, khi thu mẫu cá Chép hương và Chép giống tại khu vực Gia Lâm - Hà Nội và khu vực Từ Sơn – Bắc Ninh về kiểm tra, chúng tôi nhận thấy ấu trùng sán lá song chủ metacercaria Centrocestus formosanus và sán lá đơn chủ 16 móc Dactylogyrus chủ yếu tìm thấy ở khu vực Từ Sơn – Bắc Ninh. Đó là do khu vực này có tỷ lệ nhiễm cao từ những năm trước. Các hộ gia đình tại đây dùng phân bắc bón trực tiếp, ngoài ra một số phân hữu cơ khác như phân chuồng cũng được bổ sung, hầu hết phân không qua ủ. Còn khu vực Gia Lâm - Hà Nội, trước khi thả cá, các hộ gia đình ở đây có áp dụng các biện pháp xử lý ao kỹ càng.
1.1. Loài Trichodina nobilis Chen, 1963
Hình 3: Trichodina nobilis
tại Bắc Ninh
Hình 4: Trichodina nobilis
Theo Bùi Quang Tề
• Vị trí phân loại
Phân lớp: Peritrichia Stein, 1859 Bộ: Mobilina Kahl, 1933
Họ: Trichodinidae Clau, 1874
Giống: Trichodina Ehrenberg, 1830
Loài: Trichodina nobilis Chen, 1963
• Vật chủ: Cá Chép
• Nơi ký sinh: Da, mang
• Nơi tìm thấy: Hà Nội, Bắc Ninh
• Hình thái: Đường kính thân 70,0 – 80,0µ, vòng đĩa bám 68,0 – 78,0µ, vòng móc bám 60,8 – 64,6µ. Số lượng móc trong vòng móc bám 22 – 26. Chiều dài nhánh ngoài của móc 9,5µ, nhánh trong 13,3µ. Số lượng sọc giữa hai nhánh ngoài của móc là 12.
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra CĐN, TLN trùng bánh xe Trichodina nobilis trên cá Chép bệnh
*Ghi chú: CĐN rất cao: > 20 trùng/mẫu
CĐN cao: 10 – 20 trùng/mẫu
CĐN trung bình: 5 – 10 trùng/ mẫu CĐN thấp: < 5 trùng/mẫu
Chúng tôi tiến hành kiểm tra 8 lần, mỗi lần 30 mẫu với 240 mẫu cá bị nhiễm trùng bánh xe. Kết quả kiểm tra CĐN, TLN được thể hiện ở bảng 4.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm trùng bánh xe Trichodina nobilis rất cao, chiếm 100%. Cường độ nhiễm cao, trung bình dao động từ 22,87 trùng/1cá đến 99,36 trùng/1cá. Số lượng cá bị nhiễm với cường độ rất cao chiếm tỷ lệ lớn 216 mẫu / 240 mẫu kiểm tra, số lượng cá bị nhiễm với cường độ thấp chiếm 3 mẫu / 240 mẫu kiểm tra.
Trong quá trình thực tập, chúng tôi nhận thấy cường độ nhiễm của trùng bánh xe tăng lên theo thời gian sinh trưởng của cá. Tuy nhiên đến giai đoạn cá giống, cường độ nhiễm vẫn cao nhưng có xu hướng giảm. Nước dùng cho ương cá bột là nước giếng khoan tương đối sạch, nên hầu như cá bột không có trùng bánh xe. Vì vậy thời gian đầu ương nuôi, cá có cường độ nhiễm trùng bánh xe thấp. Khi hết giai đoạn cá bột chuyển lên giai đoạn cá
Ngày kiểm tra Số lượng mẫu (con) CĐN TLN (%) (X± SE) (trùng/1cá) Rất cao (con) Cao (con) Trung Bình (con) Thấp (con) 27/2/2010 30 22,87±5,37 13 8 6 3 100 6/3/2010 30 45,16±6,89 28 2 0 0 100 13/3/2010 30 74,47±8,62 24 0 0 0 100 20/3/2010 30 94,56±4,48 30 0 0 0 100 27/3/2010 30 61,62±3,11 30 0 0 0 100 3/4/2010 30 91,87±6,74 29 0 1 0 100 10/4/2010 30 99,36±3,49 30 0 0 0 100 17/4/2010 30 86,32±2,47 30 0 0 0 100 Tổng 240 216 10 8 3
hương, cá Chép được đưa ra nuôi tại các ao nuôi. Do quá trình cải tạo ao trước khi thả cá hương chưa được tiến hành kỹ càng, mật độ thả quá dầy, thời tiết trong thời gian thu mẫu khoảng 19oC đến 23oC, trời âm u, bên cạnh đó các hộ nuôi ở đây có thói quên bón phân không ủ hoặc chưa xử lý, vì vậy đây là những điều kiện thuận lợi cho trùng bánh xe phát triển. Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi thấy có hiện tượng cá Chép hương chết rải rác, khi kiểm tra thấy trùng bánh xe nhiễm dày đặc.
Theo Hà Ký (1963) mật độ cá thả quá dày thì cường độ cảm nhiễm trùng bánh xe của cá sẽ tăng gấp 4-12 lần. Các loại phân hữu cơ, nhất là phân bắc cần phải ủ kỹ với 1% vôi. Thực tế đã cho thấy mật độ thả cá quá dày và dùng phân tươi bón cho thì TLN và CĐN trùng bánh xe ở đây rất cao: TLN chiếm 100% số mẫu kiểm tra; CĐN rất cao, trung bình 90 - 115 trùng/mẫu.
1.2. Ấu trùng Centrocestus formosanus Nishigori, 1924
Hình 5: Ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus fomosanus
• Vị trí phân loại
Lớp: Trematoda Rudolphi, 1808
Phân lớp: Prosostomata Odhner, 1905 Bộ: Strigeata, 1937
Phân bộ: Heterophyata Morosov, 1955 Họ: Trichodinidae Clau, 1874
Giống: Centrocestus Looss, 1899
Loài: Centrocestus formosanus Nishigori, 1924
• Vật chủ: Cá Chép
• Nơi ký sinh: Mang
• Nơi tìm thấy: Hà Nội, Bắc Ninh
• Hình thái: Bào nang hình ovan, kích thước 0,16 – 0,23 × 0,125 – 0,178 mm. Giác miệng kích thước 0,039 × 0,05 mm; có 32 gai lớn xếp so le chung quanh giác miệng, chiều dài gai 0,014 – 0,016 mm. Giác bụng có kích thước 0,021 – 0,039 × 0,043 mm. Túi bài tiết hình chữ X hoặc chữ H.
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra CĐN, TLN ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus formosanus trên cá Chép bệnh
*Ghi chú: CĐN rất cao: > 20 ấu trùng/mẫu CĐN cao: 10 – 20 ấu trùng/mẫu
CĐN trung bình: 5 – 10 ấu trùng/ mẫu CĐN thấp: < 5 ấu trùng/mẫu
Trong 8 lần kiểm tra, với mỗi lần kiểm tra 30 mẫu cá, chúng tôi nhận Ngày kiểm tra Số lượng mẫu (con) CĐN TLN (%) (X± SE) (trùng/1cá) Rất cao (con) Cao (con) Trung Bình (con) Thấp (con) 27/2/2010 30 0,37±0,49 0 0 0 30 37,7 6/3/2010 30 0,60±0,67 0 0 0 30 50 13/3/2010 30 0,83±0,95 0 0 0 30 53,3 20/3/2010 30 1,53±1,33 0 0 0 30 70 27/3/2010 30 2,43±2,06 0 0 3 27 80 3/4/2010 30 1,60±1,90 0 0 2 28 73.3 10/4/201 0 30 1,87±1,75 0 0 2 28 87,7 17/4/2010 30 2,23±2,01 0 0 4 26 87,7 Tổng 240 0 0 11 229
thấy tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus formosanus tăng dần trong các lần kiểm tra, từ 37,7% lên 87,7%. Cường độ nhiễm trung bình dao động từ 0.37 ấu trùng/1 cá đến 2,43 ấu trùng/1 cá. Số lượng mẫu cá bị nhiễm với cường độ rất cao: 0 mẫu / 240 mẫu kiểm tra. Nhưng số lượng mẫu cá bị nhiễm với cường độ thấp lại chiếm rất cao: 229 mẫu /240 mẫu kiểm tra.
Khi tiến hành điều tra, chúng tôi nhận thấy giai đoạn cá Chép bột không có ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus formosanus. Đến cuối giai đoạn cá hương và giai đoạn cá giống mới thấy xuất hiện ấu trùng sán lá song chủ
Centrocestus formosanus, và tỷ lệ nhiễm tăng dần theo thời gian sinh trưởng của cá.
Theo kết quả điều tra ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus formosanus
tại khu vực Đình Bảng – Bắc Ninh của Nguyễn Thị Mai Phương, 2009 cho thấy TLN tại đây rất cao, lên đến 100% ở tất cả các đợt kiểm tra. Ở đợt kiểm tra lần thứ nhất CĐN trung bình cao, đạt 12,06 ấu trùng/mẫu, số lượng ấu trùng sán trên một mẫu từ 1 – 32 ấu trùng/mẫu. Số cá có CĐN ở mức độ cao là nhiều nhất: 14 mẫu/30 mẫu kiểm tra. Số mẫu có CĐN ở mức độ thấp là ít nhất: 2 mẫu/30 mẫu kiểm tra. So với kết quả trên thì kết quả điều tra của chúng tôi về CĐN và TLN ấu trùng sán lá song chủ Centrocestus formosanus
năm 2010 giảm rất nhiều, tỷ lệ nhiễm cao nhất đạt 87,7% nhưng số lượng ấu trùng trên một mẫu chỉ đạt 0,7 ấu trùng/mẫu. Có thể các hộ gia đình ở đây đã áp dụng các biện pháp xử lý và phòng bệnh này nên CĐN và TLN ấu trùng đã giảm.
Hình 6: Sán lá đơn chủ ký sinh trên mang cá Chép giai đoạn cá hương
• Vị trí phân loại
Phân lớp: Polyonchoinea Bychowsky, 1937
Bộ: Dactylogyridea Bychowsky, 1937
Họ: Dactylogyridae Bychowsky, 1933
Giống: Dactylogyrus Diesing, 1850
• Vật chủ: Cá Chép
• Nơi ký sinh: Mang
• Nơi tìm thấy: Hà Nội, Bắc Ninh
• Hình thái: Cơ thể Dactylogyrus nói chung rất nhỏ, dài. Lúc còn nhỏ có màu trắng nhạt và vận động rất hoạt bát. Đầu có 4 thùy đầu trong đó có 4 đôi