(Penaeus vannamei) bằng RTV đƣợc nhân lên trong tế bào Sf9.
A. Nuôi tôm trong phòng thí nghiệm
Môi trường nuôi tôm: * Nhiệt độ: 28 – 300C * pH: 7,8 – 8,5
* Độ mặn: 15 – 20‰ * Sục khí liên tục
Cho tôm ăn:
* Cá hấp xay nhỏ và lòng đỏ trứng gà * Ngày 3 buổi: 8h, 13h và 18h
* Lượng thức ăn bằng 10% trọng lượng cơ thể tôm/ngày
Vệ sinh bể:
* Vào buổi sáng và chiểu tối * Hút loại bỏ chất cặn lơ lửng
B. Thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm
Tôm trước khi thí nghiệm được chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị bệnh âm tính (phần 4.4.1và 4.4.2).
Ghi nhận số tôm sống hàng ngày sau khi gây nhiễm. Tôm chết trong nghiệm thức gây nhiễm được kiểm tra lại bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị dương tính (phần 4.4.3 và 4.4.4).
Thí nghiệm 1: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ.
Tôm 35 – 40 ngày tuổi ở Hồ Cốc – Vũng Tàu. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 7 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 8 con:
* Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng - không gây nhiễm.
* Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pmon từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.
* Nghiệm thức 3 (NT3): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pvan từ tôm TCT (RTV-
PvanM): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.
Thí nghiệm 2: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú giống.
Tôm giống 12 ngày tuổi mua ở Cần Giuộc – Long An. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 10 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 70 con:
* Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng – không gây nhiễm.
* Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pm từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng, để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày.
* Nghiệm thức 3 (NT3): sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pv từ tôm TCT (RTV-
PvanM): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày.
3.3.4 Phƣơng pháp Dot Blot 3.3.4.1 Nguyên tắc
Protein được đưa trực tiếp lên giấy lọc. Sau đó ủ với kháng thể sơ cấp, đến kháng thể thứ cấp và cho cơ chất tạo màu vào. Cuối cùng là so màu để đánh giá mức độ nhiễm bệnh.
3.3.4.2 Phƣơng pháp tiến hành:
a) Sử dụng 20 µl dịch tế bào nhiễm virus hoặc dịch nghiền đồng thể (đã được ly tâm hoặc lọc qua giấy lọc) từ mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đưa lên màng. Để yên khoảng 10 phút cho màng thấm khô.
b) Chuyển màng vào dung dịch A2, lắc nhẹ trên máy lắc trong 15 phút. Thay dịch rửa và lặp lại thêm hai lần tiếp.
c) Chuẩn bị dung dịch bloking ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch bloking ít nhất 60 phút ở 37oC. Rửa màng 1 lần với dung dịch A2 và 2 lần với dung dịch A1 trên máy lắc.
d) Chuẩn bị dung dịch K1 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K1
trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên.
e) Chuẩn bị dung dịch K2 ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch K2 trong 60 phút ở 37oC. Rửa màng như ở bước trên.
f) Chuẩn bị dung dịch DAB ngay trước khi dùng. Ủ màng trong dung dịch DAB ở 37oC cho tới khi tín hiệu màu xanh xuất hiện trên màng. Ngừng phản ứng bằng cách rửa màng ba lần với dung dịch A1. Đánh giá kết quả ngay khi màng còn ở trong dung dịch rửa hoặc khi màng đã được lấy ra và làm khô ở nhiệt độ phòng. Cường độ màu trên màng phản ánh mức độ bệnh.
Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch (Oberfelder, 1989)
(nguồn: Oberfelder, 1989; trích dẫn bởi Văn Thị Hạnh, 2001)
3.3.5 Phƣơng pháp sắc ký 3.3.5.1 Nguyên tắc
Sắc ký gel lọc (còn gọi là sắc ký rây phân tử, sắc ký gel, sắc ký thẩm thấu gel, sắc ký gel thâm nhập…) là một dạng sắc ký mới nhưng có khả năng lớn để phân tách, xác định kích thước và trọng lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử.
M a øn g N i tr o c e l l u l o s e P r o te i n k h a ùn g n g u y e ân M a øn g N i tr o c e l l u l o s e P r o te i n k h o a ù K h a ùn g th e å ñ a ëc h i e äu M a øn g N i tr o c e l l u l o s e M a øn g N i tr o c e l l u l o s e K h a ùn g th e å th ö ù c a áp ñ a ùn h d a áu e n z y m e M a øn g N i tr o c e l l u l o s e S a ûn p h a åm C ô c h a át
Kháng thể sơ cấp bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên trên màng, tạo phức kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu Protein kháng nguyên được đưa lên màng
Phần màng không gắn kháng nguyên được trám bằng protein Casein
Kháng thể thứ cấp gắn enzyme kết hợp với phức kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu
Enzyme phân hủy cơ chất, tạo phức màu trên màng. Cường độ màu phản ánh nồng độ enzyme liên quan đến protein đưa vào
Phương pháp này chủ yếu dựa trên khả năng khác nhau của các phân tử chất tan thẩm thấu vào khung gel hoặc chui qua lỗ của các rây phân tử tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử. Nghĩa là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do (pha động) và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp (pha tĩnh). Mức độ thâm nhập của các phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước lỗ và cấu trúc của chúng. Các đại phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ không thể thâm nhập vào các lỗ, các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào khe hở giữa các hạt rắn xốp và do đó bị rửa ra khỏi cột rất sớm. Các phân tử có kích thước nhỏ hơn kích thước các lỗ có khả năng thâm nhập vào lỗ. Khi dòng pha động đi qua, các phân tử đó lại ra khỏi các lỗ và di chuyển cùng pha động.
3.3.5.2. Phƣơng pháp tiến hành
1. Chuẩn bị gel
Gel sử dụng có khả năng phân tách các protein trong khoảng 5000 – 100.000 kDa
Dùng 1 cốc thủy tinh, cân 1lượng gel khô thích hợp (8,5 g gel khô) (dựa vào tỉ lệ 12 ml dung dịch đệm/1g gel khô). Sau đó cho thêm 200 ml dung dịch đệm vào rồi để yên trong 12 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Hút bỏ dịch trên, thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm để rửa gel, lập lại khoảng 4 lần.
2. Nhồi cột
Ở đây ta dùng cột có đường kính 2 cm, cao 50 cm. Đổ gel vào cột sắc ký để yên khoảng 24 giờ để gel ổn định trong cột. Sau đó rửa cột bằng đệm trong 2 giờ.
3. Đưa mẫu vào cột
Thực hiện sắc ký trên các dịch protein. Đưa mẫu vào cột cùng với dòng dung môi vì đưa mẫu như vậy không làm xáo trộn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí. Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để mẫu ngấm xuống thì đặt ống nghiệm bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2 ml dịch lọc, tốc độ chảy 0,14 ml/phút.
4. Lượng mẫu đưa vào cột
Lượng mẫu đưa vào cột phụ thuộc độ nhạy của bộ phận phát hiện mẫu, kích thước lỗ của gel, nồng độ mẫu có thể từ 2 – 100mg/ml. Thể tích mẫu đưa vào cột không quá 2% thể tích cột.
Để thu mẫu, dùng máy thu mẫu phân đoạn tự động gồm 80 ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn. Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và khi đủ 2 ml máy sẽ di chuyển sang ống khác. Mẫu thu được trong các ống nghiệm sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả SDS – PAGEHình 4.1: Kết quả SDS – PAGE Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range
Giếng 2: dịch tế bào (DTB) Sf9
Giếng 3, 4: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV-
PmLA/SLT).
Giếng 5, 6: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 7, 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA). Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
108,5 kDa
98,7
54,6
29,5
33,5
19,8
1 2 5 6 7
a
4 8 9 10
3
51-52
kDa 40
28
17-19
108
> 108 kDa
31
33
55
24
Nhận xét
Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố.
Tên mẫu Các protein của TSV đã được công bố
RTV-PmLA (SLT) RTV-PmLA RTV-PmCG RTV-PvM Bonami (1997) Lightner (1996) Trọng lƣợn g protei n ( kDa) <17 <17 <17 <17 17 17 17 19 19 19 23 24 24 24 24 24 28 28 28 31 31 31 33 33 33 36,8 40 40 40 40 40 40 49 51-52 51-52 51-52 51-52 51,5 52,5 55 55 55 55 55 58 108 108 108 >108 >108 >108
Bảng 4.4 cho thấy các mẫu nhiễm virus có nhiều vạch khác so với tế bào đối chứng: <17, 17, 19, 28, 31, 33, 40, 51, 52, 55, 108 và một vạch > 108 kD. Các mẫu nhiễm virus về cơ bản có các protein giống với các protein của TSV đã được công bố. Trong đó, protein 40 kDa có thể tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998, Mari, 2002). Tuy vậy, để khẳng định sự có mặt của các vạch protein thuộc về virus, chúng tôi thực hiện điện di miễn dịch (Western Blot) dùng kháng thể đặc hiệu để chỉ thị các vạch protein đã được chuyển thẩm lên màng lai.
4.2. Kết quả Western Blot
Hình 4.2: Kết quả Western Blot Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range.
Giếng 2, 3: dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTV-
PmLA/SLT)
Giếng 4, 5: dịch tế bào (DTB) Sf9
Giếng 6, 7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG). Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA) Giếng 9, 10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
Nhận xét
Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được thể hiện trên màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể. Kết quả xác định được một số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác so với mẫu tế bào đối chứng (Bảng 4.2)
108,5 kDa 98,7 54,6 29,5 33,5 19,8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 28 51-52 kDa 40 17-19 29 33 30-31 26 22 2 2 24
Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố.
Tên mẫu Các vạch protein thu đƣợc (kDa) RTV- PmoLA/LT >108 52 51 40 RTV-PmoCG 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PmoLA 52 51 40 có 4 vạch 29, 30-31, 33 kDa RTV-PvanM 52 51 40 24 có 9 vạch trong khoảng 17- 29 kDa TSV đã công bố Lightner (1996), Bonami (1997) 58 55 52,5 51,5 49 40 36,8 24 23
Kết quả bảng trên cho thấy tất cả các mẫu dịch tế bào nhiễm virus gây bệnh đỏ đuôi đặc trưng ở cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng về cơ bản có các protein giống nhau. Tuy nhiên RTV từ tôm thẻ có nhiều protein hơn từ tôm sú.
Các mẫu tế bào nhiễm RTV có các protein trùng với TSV đã công bố là 52, 51 và 40 kD. Đây là các protein chính của RTV ở cả tôm sú và tôm TCT, trong đó có protein 40 kD tương ứng với VP2 (40 kDa) là protein đặc trưng có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997, Mari, 1998)
RTV-PmoLA/LT: Có 3 protein trọng lượng giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 2 protein có trọng lượng >108 kDa.
RTV-PmoLA: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa
RTV-PmoCG: Có 3 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 4 protein có trọng lượng 29, 30 – 31 và 33 kDa
RTV-PvanM: Có 4 protein giống TSV như các tác giả đã công bố. Ngoài ra còn có thêm 9 protein có trọng lượng 33, 31, 30, 29, 28, 26, 22, 19 và 17 kD.
Sử dụng RTV ở tôm sú nhân qua tế bào làm kháng nguyên để thu kháng thể đặc hiệu dùng cho phương pháp Western Blot (Hình 4.2). Kết quả thu được các protein đặc trưng rất tách biệt ở mẫu RTV từ tôm TCT (RTV-PvM). Kết quả trên cho thấy kháng thể đặc hiệu RTV từ tôm sú đã nhận biết RTV từ tôm TCT. Như vậy có thể giả thiết rằng RTV ở tôm sú có quan hệ gần với RTV ở tôm thẻ chân trắng.
A B
Để khẳng định lại các protein mà chúng tôi thu được từ kết quả điện di SDS- PAG và Western blot chính là protein của RTV, chúng tôi tiến hành gây nhiễm trở lại trên tôm thẻ thịt và tôm sú giống bằng dịch tế bào nhiễm RTV.
4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm
4.3.1 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm Chỉ tiêu quan sát
Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống
Nghiệm thức 1 / Đối chứng 8 2 6 75%
Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 8 8 0 0%
Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 8 8 0 0%
Kết quả cho thấy:
- Qua bảng 4.1 có thể thấy tỉ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3)
- Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm thẻ.
- Tôm ở hai bể gây nhiễm chết trong lúc lột xác, đỏ đuôi, hoại tử lan dàn từ mép đuôi quạt vào, chết liên tục trong 7 ngày (sau 2 tuần gây nhiễm) (Hình 4.4).
Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm. Hình A: Tôm thẻ không gây nhiễm
B
A
Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV.
Hình A: Tôm thẻ chết trong lúc lột xác, có nhiều đốm hoại tử trên thân, đuôi đỏ
Hình B: Tôm thẻ chết có biểu hiện đỏ đuôi.
4.3.2 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm
Chỉ tiêu quan sát
Phƣơng pháp Tổng số Số chết Số sống Tỷ lệ sống
Nghiệm thức 1 / Đối chứng 70 24 46 66%
Nghiệm thức 2 / RTVPmoLA 70 51 19 27%
Nghiệm thức 3 / RTVPvanM 70 45 25 36%
Kết quả cho thấy:
Qua bảng 4.2 có thể thấy tỷ lệ sống chết ở các nghiệm thức gây nhiễm và không gây nhiễm có sự khác biệt về mặt thống kê (P << 0,05) (Phụ lục 3).
Kết quả ở đợt thí nghiệm này cho thấy RTV có nguồn gốc từ tôm sú hay tôm TCT đều có khả năng gây nhiễm cho tôm sú giống.
Quan sát ghi nhận được ở các thí nghiệm trên cho thấy khoảng 10 ngày sau khi gây nhiễm, phần lớn tôm chuyển màu đỏ ở đuôi quạt, vây râu và ăng ten (Hình 4.6). Sau đó xuất hiện các vết đen hoại tử và toàn thân chuyển màu hồng nhạt hoặc đỏ (Hình 4.6). Sau hai tuần gây nhiễm tôm có biểu hiện bỏ ăn, bơi lờ đờ và thường bị chết khi lột xác. Tỷ lệ chết 100% sau 24 ngày gây nhiễm. Các dấu hiệu quan sát thấy cũng tương tự như tôm bị bệnh tự nhiên: Phần đuôi đỏ hoại tử lan dần từ quạt đuôi lên các
đốt thân phía trên, vỏ thân mỏng, lỏng lẻo. Phần vây râu và ăng ten chuyển sang màu đỏ sau 10 ngày gây nhiễm (Hình 4.6). Sau 15 ngày gây nhiễm phần đuôi tôm chuyển màu đỏ đậm. Tế bào biểu mô sưng phồng. Đám hoại tử màu đen (Hình 4.7) bắt đầu xuất hiện ở quạt đuôi.
Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40)
Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV
