Amano)
Hóa chất
HCl 0,1 M Na2CO3 0,4M
Dung dịch Trichloacetic (TCA 0,4 M) Tyrosin tinh khiết
Thuốc thử Folin
Đệm phosphat pH = 7; 0,1 M Dung dịch Casein 1%
Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt
Máy đo quang phổ UV - Vis Máy đo pH
Nguyên tắc
Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của Enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của Enzyme. Hoạt động của Enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của Enzyme.
Các bước tiến hành
Xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosin
Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g/ml dung dịch HCl.
Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp.
Trộn đều, để yên dung dịch ở 470C ±0,50C trong 20 phút.
Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50.
Đối với ống đối chứng: Dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm, ghi nhận kết quả là As0.
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 5 trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD5. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn Tyrosin ở hình 3.6 (Phụ lục trang 61)
Xác định hoạt tính Enzyme protease
Cho 1 ml dung dịch Casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 470C ±0,50
C trong 10-15 phút.
Cho 1 ml dịch chiết Enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 470C ±0,50C trong 1 giờ.
Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng Enzyme.
Để yên dung dịch trong 25 phút, lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Hút 1 ml dịch lọc .
Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1 ml dịch lọc. Thêm vào 1 ml thuốc thử Folin.
Trộn đều, để yên ở 470C ±0,50C trong 20 phút.
Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 660nm (ghi nhận kết quả này là Am).
Mẫu đối chứng: Lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch Enzyme và tiến hành các bƣớc nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả này là A0.
Tính toán
Hàm lƣợng Tyrosin đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng cách lấy (Am- A0) rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease.
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) Enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng Enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm.
Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/ml)= (Am- A0)*F*n*1/100 Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/g)= (Am- A0)*F*n*1/100*V/m
F= [(10/As10-A0)+(20/As20-A0)+(30/As30-A0)+(40/As40-A0)+(50/As50-A0)]/5 Am: độ hấp thu của mẫu
A0: độ hấp thu của ống đối chứng
F : hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng Tyrosin và độ hấp thu ở bƣớc sóng 660nm trên đƣờng chuẩn.
n: hệ số pha loãng của Enzyme 1/100: hệ số chuyển đổi
V: thể tích của dung dịch Enzyme m: khối lƣợng chế phẩm Enzyme thô.
3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease từ nội tạng tôm
[4]
Quá trình tách chiết thu Enzyme đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0- 40C) để hạn chế sự biến tính của protein – Enzyme dƣới tác động của môi trƣờng.
Quy trình
Nội tạng tôm Nghiền mịn
Chiết rút Enzyme protease Ly tâm thu dịch chiết
Dịch chiết Enzyme thô
Kết tủa Enzyme protease (cặn tủa) Ly tâm thu chế phẩm thô
Thu nhận chế phẩm Enzyme protease thô bằng máy đông khô. Chế phẩm thô này đƣợc bảo quản trong ngăn đá ở nhiệt độ -200C và sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm.
Các bước tiến hành
Nội tạng đƣợc nghiền mịn với cát thạch anh trong cối inox đặt trong đá vụn.
+ Chiết rút thu dịch chiết
Dùng nƣớc muối sinh lý 0,9% đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh với tỷ lệ dung môi/mẫu = 3/1 trong 40 phút.
Trong quá trình chiết khuấy đảo liên tục, ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch chiết.
+ Thu nhận chế phẩm protease
Kết tủa thuận nghịch protein – Enzyme trong dịch chiết thu đƣợc bằng tác nhân thích hợp: Ethanol 960 (cồn) với tỷ lệ Ethanol: dịch chiết = 4:1 trong 60 phút.
Cồn đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh cho từ từ vào dịch chiết đến tỷ lệ gây tủa protease, giữ lạnh 0-40C trong 60 phút, sau đó ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút thu chế phẩm thô. Xác định hoạt tính của Enzyme chế phẩm thô theo phƣơng pháp Amano.