IV.1. Qui trình tạo chế phẩm AH
Hình 9: Sơ đồ tạo chế phẩm AH.
IV.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Bảng 7: Phương pháp xử lý nguyên liệu.
Nguyên liệu sau
sơ chế (dạng bột) Nguồn gốc Tác dụng
A - Thu mẫu tại biển Cần Giờ.
- Nguyên liệu ở dạng tươi được sấy khô, xay nhuyễn.
Có tác dụng giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh cho tôm. B - Có nguồn gốc từ mô động vật được
thu nhận tại Kỹ nghệ súc sản Vissan. C - Nguyên liệu ở dạng hạt.
- Xay nhuyễn và rang khô.
D - Nguyên liệu ở dạng bột có nguồn gốc từ bò.
Có tác dụng tăng cường khả năng thực bào ở tôm. Nguyên liệu sau sơ chế
ở dạng bột khô. Phối trộn các thành phần theo tỷ lệ thích hợp Sấy khô Xay nhuyễn Chế phẩm AH Vi khuẩn chủng L Nhân sinh khối
Nguyên liệu A
Nguyên liệu B
Nguyên liệu C
+ Môi trường nhân sinh khối vi sinh vật
- Ngâm đậu với nước theo tỷ lệ 1:2,5 trong 3-4 giờ. - Xay nhuyễn với nước cất theo tỷ lệ 1:6.
- Lọc qua vải mịn.
- Dịch lọc được hấp khử trùng.
IV.1.2. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu sinh hóa của nguyên liệu
IV.1.2.1. Protein thô
+ Nguyên tắc
- Trước hết tách chiết protein có trong mẫu bằng cồn, kế đó là bằng nước và cuối cùng là nước có pha acid loãng.
- Sau khi chiết được protein, chúng ta phải tách nó ra khỏi dung dịch (có nghĩa là kết tủa chúng).
+ Tiến hành Nguyên liệu
Tách chiết protein với cồn 700
Tách chiết protein với nước cất
Thu dịch
Tủa bằng acid Trichloacetic 10% Protein tươi (a gram) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cân một lượng nhỏ protein tươi (b gram)
Xác định hàm lượng protein thô
Hình 11: Sơ đồ tiến hành định lượng protein.
- Cân 5gram mẫu nguyên liệu đã xay nhuyễn, cho vào cối nghiền. Thêm vào đó bốn lần trọng lượng cồn 70o, nghiền trong 15 phút.
- Thu lấy dịch, còn bã tiếp tục chiết với nước cất (4 lần trọng lượng nguyên liệu) và ly tâm. Tách chiết 3 lần.
- Dồn tất cả dịch chiết sau ly tâm và thêm vào đó một lượng acid tricloacetic 10% có thể tích như thể tích dịch chiết, khuấy đều .
- Để yên ở nơi lạnh trong 2 giờ, protein sẽ kết tủa; lắng gạn bớt dịch trong. Ly tâm lấy cặn bằng ống ly tâm khô (đã cân gọi là bì).
- Sau khi ly tâm, ta thu được protein. Đem cân lại và trừ bì, ta được trọng lượng protein tươi (a gram).
- Cân một lượng nhỏ protein tươi (b gram), đem sấy khô. Sau đó, đặt trong bình hút ẩm và cân lại để xác định trọng lượng khô (c gram).
- Thực hiện như trên đối với các mẫu còn lại.
- Công thức tính hàm lượng protein thô trong 100 gram nguyên liệu
x: trọng lượng nguyên liệu ban đầu (5 gram). a: trọng lượng protein tươi (gram).
b: lượng protein tươi trước khi sấy khô (gram). c: lượng protein tươi sau khi sấy khô (gram).
IV.1.2.2. Chất béo thô
+ Nguyên tắc
Nguyên liệu đã được làm khô, sau đó ly trích lipid ra khỏi nguyên liệu bằng eter petron trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất béo.
+ Tiến hành
- Rửa sạch, sau đó tráng lại bằng một ít aceton mặt trong bình cầu và ống trụ của máy Soxhlet. Sấy khô ở tủ sấy.
- Sấy khô các mẫu nguyên liệu và đặt vào bình hút ẩm. Sau đó, cân mẫu bằng cân phân tích và tiến hành cân lặp lại cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân không chênh lệch quá 1mg.
- Gói các mẫu bằng giấy lọc (đã được sấy và cân khối lượng). Cho các gói mẫu đựng nguyên liệu vào ống thủy tinh hình trụ của máy Soxhlet.
c.a.100
%protein thô = (%) b.x
- Lắp ống thủy tinh hình trụ vào bình cầu của máy. Cho eter petron vào bình cầu (lượng eter petron khoảng ¾ thể tích bình cầu).
- Lắp cột làm lạnh vào và cho nước hoàn lưu (kẹp để giữ máy). Đun ở nhiệt độ 40-450C để ly trích lipid trong 8-10 giờ với điều kiện dung môi chảy đầy ống hình trụ và tự động chảy xuống bình cầu.
- Kiểm soát nguyên liệu đã được trích hết lipid bằng cách:
x Eter trong ống hình trụ không có màu.
x Lấy vài giọt dung môi trong ống hình trụ, nhỏ vào miếng giấy lọc. Nếu vết loang sau khi khô dung môi không phân biệt được trên nền giấy trắng thì coi như là đã ly trích hết lipid.
- Sau khi kiểm tra, nếu đạt thì lấy các gói mẫu ra và sấy khô, để trong bình hút ẩm. Cân bằng cân phân tích khối lượng các mẫu và cân lặp lại cho tới khi khối lượng không đổi.
+ Tính kết quả
Hàm lượng lipid thô trong nguyên liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m: khối lượng mẫu ban đầu.
m1: khối lượng mẫu + giấy gói ban đầu. m2: khối lượng mẫu + giấy gói cuối cùng. III.1.2.3. Đường tổng số hòa tan
+ Nguyên tắc
Xác định hàm lượng đường dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường với sự hiện diện của acid sulfuric.
+ Tiến hành
- Cân 1g nguyên liệu tươi đã xay nhuyễn, cho vào cốc đun.
- Thêm 10ml cồn 900. Sau đó, để cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần. Để nguội và lọc qua lọc không tro.
- Sau đó, lại cho 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều; đun 2 lần tới sôi trên nồi cách thủy. Để nguội, lại lọc tiếp tục. Chiết tách như vậy 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rữa sạch 3 lần bằng cồn 800 (đã đun nóng).
100.(m1-m2) %lipid =
- Tất cả phần dịch chiết được cho bay hơi trên nồi cách thủy đun nhẹ. - Cặn khô trong cốc được pha loãng với nước cất (dùng bình định mức). - Hút 1ml dung dịch đường đã pha loãng vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch phenol 5%.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 5ml H2SO4 đậm đặc.
- Để yên 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 20 phút ở 300C để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác độ cường độ màu bằng quang phổ kế ở 490nm.
- Tiến hành như trên đối với các mẫu còn lại. + Dựng đồ thị chuẩn
- Hút 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml dung dịch saccharose 0,1% và pha loãng trong các bình định mức 100ml.
- Hút 1ml từng dung dịch trên đem làm hiện màu như trên và đo OD ở bước sóng 490nm.
IV.1.3. Phương pháp khảo sát chỉ tiêu vi sinh vật trong chế phẩm AH
IV.1.3.1. Phương pháp nhuộm Gram quan sát hình thái
- Lau lame bằng cồn 900.
- Nhỏ một giọt nước cất lên lame. - Huyền phù vi khuẩn và tạo vết bôi. - Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt 1 miếng giấy thấm lên lame.
- Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh (Violet crystal) 10%, để 1 phút. - Thêm vài giọt dung dịch lugol vào, để 1 phút.
- Rửa nước, tẩy bằng cồn cho tới khi mất màu.
- Rửa lại bằng nước, nhỏ vài giọt dung dịch fushin, để 30 giây. - Rửa nước, dùng giấy thấm khô lame.
- Xem dưới vật kính dầu (x100).
IV.1.3.2. Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh hóa
+ Thử nghiệm Methylred
- Hấp khử trùng 2 ống nghiệm trên.
- Để nguội, cấy một ít vi khuẩn chủng A vào một ống nghiệm, ống còn lại không cấy vi khuẩn.
- Ủ 2 ống nghiệm ở 370C/24 giờ.
- Nhỏ vài giọt methylred vào 2 ống nghiệm và quan sát kết quả. - Đọc kết quả: Màu của methyl red sau khi được nhỏ vào môi trường
x Giữ nguyên màu đỏ: phản ứng (+). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
x Chuyển từ đỏ sang vàng: phản ứng (-). + Thử khả năng lên men Carbohydrate
- Sử dụng 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường Phenol Red Broth. - Hấp khử trùng.
- Bổ sung 1% đường (lactose, maltose và sucrose) vào 3 ống nghiệm. - Cấy vi khuẩn và ủ 370C/24 giờ.
- Đọc kết quả:
x Môi trường chuyển sang màu vàng, có sinh khối: phản ứng (+).
x Môi trường giữ nguyên màu đỏ: phản ứng (-).
IV.1.4. Thu nhận sinh khối vi sinh vật
Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đo độ đục - Sử dụng 2 ống nghiệm
+ Ống 1: môi trường lỏng đặc trưng.
+ Ống 2: hoạt hóa vi khuẩn trong môi trường lỏng đặc trưng. - Ủ ở 37oC.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 610nm với ống 1 làm ống đối chứng. - Trải đĩa để xác định mật độ: mỗi OD610nm được pha loãng thành nhiều nồng độ, mỗi nồng độ trải ra 3 đĩa.
- Ủ37oC /12 giờ.
- Đếm số lượng khuẩn lạc rời.
- Xây dựng đồ thị tương quan giữa mật độ quang (OD610nm) và số lượng tế bào.
- Công thức tính
C: tổng số vi khuẩn trong 1ml (cfu/ml). N: tổng số khuẩn lạc đếm được.
n: số đĩa đếm được trong một nồng độ. v: thể tích lấy để trải (ml).
f: độ pha loãng.
- Dựa vào giá trị OD đo được để thu được mật độ vi khuẩn cần thiết.
IV.2. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa của chế phẩm AH
Phương pháp xác định hàm lượng protein thô
(Bằng phương pháp Kjeldahl theo Tiêu chuẩn Ngành Thủy sản Việt Nam) + Nguyên tắc:
x Vô cơ hóa:
- Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng nào (hữu cơ, protein hay vô cơ) thành hợp chất vô cơ là Amonium Sulphate (NH4)2SO4 bằng cách đun với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác.
x Phương pháp Kjeldahl:
- Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng Amonium Sulphate đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra Amoniac.
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4
- Sau đó lượng Amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng máy Parnas- Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây có thể xác định được lượng Amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu.
N C(cfu/ml) = n1v1f1 +…+ nivifi H2SO4 đđ Chất đạm (NH4)2SO4 Xúc tác, to
+ Tiến hành: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
x Vô cơ hóa: Cho 3 mẫu chế phẩm AH vào 3 bình như sau
Bảng 7: Vô cơ hóa mẫu
Bình 1 Bình 2 Bình 3
Khối lượng mẫu (g) 0,502 0,501 0,507
CuSO4 (g) 1,007 1,002 1,015
K2SO4 (g) 3,006 3,018 3,078
H2SO4 đđ (ml) 10 15 20
- Đặt nghiêng mỗi bình trên bếp điện và đun trong tủ hút khí độc. Ban đầu đun nhẹ cho đến khi sủi bọt và hòa tan hết mẫu. Sau đó, tăng nhiệt độ đun cho đến khi dịch trong bình có màu xanh nhạt và trong suốt.
- Tắt điện ở bình nào có màu xanh nhạt và trong suốt. Để nguội và pha thành 100ml với nước cất.
x Chưng cất đạm
- Đun sôi bình nước của máy Parnas-Wargner. - Rửa hệ thống bằng nước cất.
- Đặt bình tam giác có chứa 20ml H2SO4 0,1N và vài giọt đỏ Methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch.
- Hút 5ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml và cho vào máy Parnas-Wargner.
- Sau đó, cho thêm 5ml NaOH đđ (phải cho chảy từ từ vì nếu cho chảy xuống quá nhanh thì dung dịch sẽ bị máy hút ra ngoài).
- Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn Amoniac sang bình tam giác. Sau một thời gian thì hạ bình tam giác xuống (dùng giấy quỳ thử một giọt bay ra, nếu không đổi màu thì đã hết lượng Amoniac; còn nếu đổi màu thì lần sau để lâu hơn) và tráng vòi của máy bằng bình tia nước cất.
- Lấy bình ra và định lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH 0,1N (có hệ số điều chỉnh là x) cho đến khi dung dịch đổi màu từ màu hồng sang màu da cam. Thực hiện 3 thử thật và 2 thử không.
x Xác định hệ số điều chỉnh
- Dùng bình tam giác có chứa 20ml NaOH 0,1N và vài giọt Methyl red. - Định phân NaOH bằng acid oxalic 0,1N cho đến khi dung dịch đổi màu từ da cam sang hồng nhạt. Lập lại 3 lần.
* Khảo sát hàm lượng lipid thô và hàm lượng đường tổng số hòa tan theo phương pháp như trên.
IV.3. Phương pháp thử khả năng đối kháng của chủng L trong chế phẩm AH với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
+ Chuẩn bị môi trường
- TCBS agar: nấu môi trường bằng lò viba cho tới vừa sôi, nhấc xuống, đợi nguội rồi đổ đĩa (không hấp khử trùng).
- Môi trường MRS lỏng: nấu môi trường, hấp khử trùng, đợi nguội và hoạt hóa giống.
+ Cấy vi khuẩn
- Huyền phù khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus vào nước muối sinh lý (8,5‰).
- Hút 100µl dịch huyền phù cho vào đĩa môi trường TCBS agar. - Dùng que trải để trải dày Vibrio parahaemolyticus.
- Vi khuẩn chủng L:
x Nhân sinh khối trong môi trường MRS lỏng.
x Ủ 370C/ 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
x Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
x Lọc qua màng lọc với đường kính lỗ 0,22µm.
x Pha loãng dịch lọc thành các nồng độ khác nhau.
x Dùng dịch lọc này để thử nghiệm đối kháng. + Phương pháp thử nghiệm đối kháng
- Dùng pince cong đặt giấy thấm vô trùng lên môi trường TCBS đã trải dày Vibrio parahaemolyticus.
- Dùng pippetman hút dịch lọc và nhỏ lên giấy thấm. - Đậy nắp đĩa petri, đặt vào tủ ấm 370C/24 giờ.
Hoạt hóa chủng A Trải dày Vibrio parahaemolyticus. trong môi trường MRS trên môi trường TCBS agar
- Xem kết quả và đo đường kính vòng kháng khuẩn.
Hình 12: Sơ đồ thử nghiệm khả năng đối kháng.
Ly tâm thu dịch (5.000vòng/phút, 15 phút) Lọc vô khuẩn Nhỏ dịch lọc lên giấy thấm Đặt giấy thấm Ủ 370C/ 24 giờ Vòng kháng khuẩn
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN