X = x(t)
3.3.10 Hàm lượng acid dễ bay hơi [171]
3.3.10.1 Cách tiến hành
− Lấy chính xác 20mL mẫu cho vào bình định mức, rồi rĩt vào bình cầu của bộ cất. Dùng khoảng 20mL nước cất tráng sạch bình định mức 2 – 3 lần để chuyển tồn bộ rượu vào bình cầu. Lắp hệ thống chưng cất, hứng dịch cất vào bình định mức trên. − Sau khi chưng cất được 2/3 dung tích bình mức và nhiệt độ hơi cất đạt 100oC thì
ngừng cất. Thêm nước cất gần vạch mức, để ở 20oC trong 30 phút. Sau đĩ thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều.
− Lấy 10mL dịch cất cho vào erlen 100mL, thêm 3 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho tới khi cĩ màu hồng bền. Thêm 1mL tinh bột, 5mL acid sulfuric và chuẩn độ với I2 0,02N cho đến khi cĩ màu xanh nhạt.
3.3.10.2 Tính kết quả
Acid dễ bay hơi (g acid acetic /100mL rượu vang) = 0,6 × [(mL NaOH × N NaOH) – (mL I2× N I2)]
3.3.11 Mật độ tế bào [3]
− Đối với nấm men trong dịch lên men: pha lỗng mẫu rồi sau đĩ đếm trên buồng đếm Thoma.
− Đối với nấm men cố định: rã hạt bằng dung dịch EDTA 5%, sau đĩ pha lỗng mẫu đến nồng độ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma.
KẾT QUẢ và BÀN LUẬN
3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
Như chúng ta đã biết, đường cĩ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, tác động đến sự sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp cồn của nấm men. Khi hàm lượng đường càng cao thì nấm men càng bị ức chế.
Trong phần nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate với hàm lượng đường ban đầu là 200, 240, 280, 320 và 360g/L. Chúng tơi bổ sung thêm đường để đạt được các giá trị như trên.
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học
quá trình sinh trưởng của nấm men
Kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men được chúng tơi trình bày trong hình 4.1, hình 4.2 và bảng 4.1. Kết quả cho thấy khi hàm lượng đường ban đầu tăng từ 200 đến 240g/L thì mật độ tế bào nấm men trong dịch lên men tăng và tốc độ sinh trưởng riêng cũng tăng:
− Mật độ tế bào nấm men cố định cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men cố định ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và 0,344 h-1.
− Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và 0,764 h-1.
Nhưng nếu hàm lượng đường ban đầu tăng cao hơn nữa (240 – 360g/L) thì mật độ tế bào giảm và tốc độ sinh trưởng riêng cũng giảm. Như vậy, khi mơi trường lên men chứa quá nhiều đường, khả năng sinh trưởng của nấm men sẽ bị ức chế. Nguyên nhân là do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu:
− Khi nồng độ cơ chất đạt đến một giá trị tới hạn nào đĩ, hoạt độ nước giảm và xảy ra sự co tế bào chất làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men [12].
− Patterson và cộng sự (1995) cho rằng áp suất thẩm thấu cao làm bất hoạt các enzyme quan trọng đảm nhiệm nhiệm vụ sao mã DNA [123].
− Cheftel (1995) thì cho rằng khi tế bào chịu áp lực thẩm thấu cao, pH nội bào giảm đi 0,2 đơn vị. Do đĩ, hoạt động của nấm men sẽ bị ức chế vì pH nội bào thấp [123].
Hình 4.28: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L)
Charoenchai và cộng sự (1998) cũng cho rằng tăng hàm lượng đường trong dịch nho từ 200 – 300g/L làm giảm tốc độ sinh trưởng và sinh khối tế bào. Kết quả này cĩ khác biệt một ít về mặt số liệu so với chúng tơi: theo các tác giả này thì khi hàm lượng đường tăng từ 200g/L trở lên thì sẽ ức chế sự sinh trưởng của nấm men, trong khi đĩ, theo chúng tơi thì hàm lượng đường phải từ 240g/L trở lên mới cĩ sự ức chế. Nguyên nhân cĩ thể là do sự khác biệt về chủng nấm men và thành phần hĩa học của dịch nho dùng để lên men [37]. Nhưng nhìn chung, kết quả này vẫn cho thấy quy luật tương tự như kết quả của chúng tơi là khi hàm lượng đường tăng cao đến một giá trị nhất định nào đĩ thì sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của nấm men.
Chúng tơi thấy rằng: trong trường hợp lên men bằng nấm men cố định, khi hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 320g/L, mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng riêng luơn luơn thấp hơn so với nấm men tự do. Kết quả của chúng tơi tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Banyopadhyay và cộng sự (1982) [16] về nấm men cố định trên thủy tinh xốp, Doran và cộng sự (1985) [56] về nấm men cố định trên gelatin, Sogoyan và cộng sự [138]; Melzoch và cộng sự (1994) [142] về nấm men cố định trong gel alginate … Nguyên nhân của hiện tượng này được các tác giả giải thích là do sự nảy chồi của tế bào bị
Hình 4.29: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Tuy nhiên, kết quả này lại trái ngược với kết quả của Wada và cộng sự (1980) khi nghiên cứu về nấm men cố định trong carrageenan. Các tác giả này cho rằng nấm men cố định sinh trưởng tốt hơn nấm men tự do, mật độ tế bào nấm men trong gel cao gấp 10 lần so với mật độ tế bào nấm men tự do [201]. Nguyên nhân cĩ sự khác biệt về kết quả của chúng tơi so với kết quả của các tác giả này cĩ thể là do sự khác nhau về chủng nấm men, thành phần hĩa học của mơi trường lên men và cấu hình khơng gian của chất mang sử dụng.
Nhưng khi hàm lượng đường đạt 360g/L thì tuy nấm men tự do cĩ mật độ tế bào cao hơn nhưng tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lại nhỏ hơn so với nấm men cố định. Ngồi ra, khi hàm lượng đường nằm trong khoảng 320 – 360g/L, thời gian cần thiết để nấm men tự do đạt được tốc độ sinh trưởng riêng cực đại lâu hơn so với nấm men cố định (8h so với 4h).
Bên cạnh đĩ, kết quả phân tích ANOVA (bảng 4.1) cịn cho thấy rằng khi hàm lượng đường tăng, giá trị tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax của nấm men tự do bị ảnh hưởng nhiều hơn so với nấm men cố định. Khi hàm lượng đường tăng từ 240 – 360g/L, µmax của nấm men tự do giảm mạnh, từ 0,764 giảm xuống cịn 0,240 h-1, trong khi đĩ giá trị µmax của nấm men cố định khơng cĩ sự khác biệt (P < 0,05) (chỉ trừ trường hợp µmax tại 240g/L so với µmax tại 320 và 360g/L là khác nhau cĩ nghĩa). Điều đĩ cho thấy rằng hàm lượng đường cao ức chế sự sinh trưởng của nấm men tự do nhiều hơn so với nấm men cố định.
Bảng 4.16: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax (h-1) Nấm men cố định Nấm men tự do 200 0,248 ± 0,016a 0,458 ± 0,022d 240 0,344 ± 0,018c 0,764 ± 0,018g 280 0,320 ± 0,023bc 0,671 ± 0,020f 320 0,310 ± 0,011b 0,520 ± 0,016e 360 0,308 ± 0,013b 0,240 ± 0,016a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập.
Các giá trị cĩ ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau cĩ nghĩa (P < 0,05).
Cĩ nhiều tác giả đã đưa ra những giả thuyết khác nhau để giải thích cho hiện tượng trên [12, 15, 43, 52, 60, 113,150, 198]. Tuy nhiên, theo chúng tơi, trong trường hợp này, hiện tượng trên cĩ thể được giải thích bởi một số nguyên nhân chính sau:
− Sự cĩ mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu do hàm lượng đường cao gây ra. Trong khi nấm men tự do phải tiếp xúc ngay với mơi trường cĩ hàm lượng đường cao thì nhờ cĩ lớp chất mang, nấm men cố định tiếp xúc chậm hơn, do đường cần cĩ thời gian để khuếch tán từ bên ngồi vào bên trong chất mang, nhờ đĩ nấm men cố định ít bị ức chế hơn [12].
− Theo Vieira và cộng sự (1989), khả năng chịu đựng đối với áp lực thẩm thấu của glucose càng tăng khi mơi trường chứa càng nhiều ion Ca2+ và/hoặc Zn2+ [198]. Như vậy, do cố định trong gel Ca-alginate nên trong mơi trường lên men của nấm men cố định chứa nhiều ion Ca2+ hơn so với nấm men tự do, do đĩ mà khả năng chịu đựng áp lực thẩm thấu cao hơn.
Ngồi ra, theo như kết quả được trình bày trong hình 4.1 thì sau khi đạt đến giá trị cực đại, mật độ tế bào nấm men tự do giảm nhanh, trong khi đĩ mật độ tế bào nấm men cố định giảm rất chậm và gần như ổn định cho đến khi kết thúc quá trình lên men chính. Điều đĩ cĩ nghĩa là, trong giai đoạn cuối của quá trình lên men, đối với nấm men tự do, tốc độ chết lớn hơn nhiều so với tốc độ sinh sản, cịn đối với nấm men cố định thì tốc độ chết gần như bằng với tốc độ sinh sản. Quan sát của chúng tơi trong quá trình thí nghiệm cũng cho thấy rằng tỷ lệ chết của tế bào cố định thấp hơn so với tế bào tự do (kết quả khơng trình bày ở đây). Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Wada và cộng sự (1980) [201]; Gịdia và cộng sự (1987) [82] về nấm men cố định trong carrageenan, Melzoch và cộng sự (1994) về nấm men cố định trong alginate [142],…. Theo chúng tơi, nguyên nhân là do nấm men tự do bị ức chế bởi hàm lượng cồn tạo thành trong quá trình lên men, cịn nấm men cố định thì ít bị ức chế hơn. Mặc dù hàm lượng cồn trong giai đoạn này cịn thấp nhưng cũng đủ để ức chế hoạt động của nấm men, vì theo D'Amore and Stewart (1987), tốc độ phát triển và khả năng sống sĩt của nấm men bị ảnh hưởng khi nồng độ ethanol thấp hơn, trong khi đĩ tốc độ lên men thì bị ảnh hưởng khi nồng độ ethanol cao hơn [163].
Nhưng khi hàm lượng đường cao (280 – 360g/L) thì tỷ lệ thốt bào cao hơn, đạt khoảng 8,5%. Nguyên nhân cĩ lẽ là do hàm lượng đường cao đã tạo ra áp suất thẩm thấu lớn lên mạng gel, làm giảm độ bền gel.
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học
quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men
Kết quả khảo sát của chúng tơi về ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình sử dụng chất khơ trong lên men vang được trình bày như trong hình 4.3. Và chúng tơi cũng khảo sát kỹ hơn về quá trình sử dụng các hợp chất chính là đường, nitơ amin tự do và nitơ ammonium trong quá trình lên men (hình 4.4, hình 4.8, hình 4.9).
Hình 4.30: Sự thay đổi nồng độ chất khơ trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Quan sát sự thay đổi hàm lượng chất khơ trong suốt quá trình lên men chính (Hình 4.3), chúng tơi nhận thấy rằng mặc dù sự sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấm men tự do nhưng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Điều này cũng tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác: Galazzo và cộng sự, 1987; Galazzo và Bailey, 1989, 1990; Doran và cộng sự, 1985; Parascandola và cộng sự, 1992; Ciani và Ferraro, 1996; Balli và cộng sự, 2003; Mallouchos và cộng sự, 2003….
Sogoyan và cộng sự khi cố định nấm men trong chất mang alginate cũng đã kết luận rằng việc cố định nấm men làm tăng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men 6 lần nhưng lại giảm khả năng sinh sản của nĩ 10 – 11 lần [138].
3.4.2.1 Quá trình sử dụng đường
Hình 4.31: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Trong suốt quá trình lên men, hàm lượng đường cịn lại trong mơi trường lên men bởi nấm men cố định luơn thấp hơn so với mơi trường lên men bởi nấm men tự do. Đồng thời, hàm lượng đường sĩt trong canh trường của nấm men cố định cũng thấp hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L thì sự khác nhau là khơng cĩ nghĩa) (bảng 4.2). Bên cạnh đĩ, tốc độ sử dụng đường (thể hiện rõ hơn qua giá trị tốc độ sử dụng đường cực đại được trình bày trong bảng 4.3) của nấm men cố định cũng cao hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L). Điều đĩ dẫn tới tốc độ sử dụng đường riêng và tốc độ sử dụng đường riêng cực đại (Hình 4.6, bảng 4.4) của nấm men cố định cũng cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men cố định cao hơn khoảng 2 – 3 lần so với nấm men tự do.
Bảng 4.17: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sĩt trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu Hàm lượng đường sĩt (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự do 200 2,01 ± 0,43a 2,40 ± 0,44a 240 3,10 ± 0,26a 7,80 ± 0,72b 280 10,00 ± 1,00b 15,32 ± 0,14c 320 22,73 ± 1,55d 85,80 ± 2,55f 360 76,95 ± 1,92e 124,98 ± 3,58g
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị cĩ ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau cĩ nghĩa (P < 0,05).
Hình 4.32: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Dựa vào sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong suốt quá trình lên men (Hình 4.5), chúng tơi cũng thấy rằng tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định đạt cực đại sau 12h lên men (trừ trường hợp hàm lượng ban đầu là 360g/L thì sau 36h lên men), trong khi đĩ tốc độ sử dụng đường của nấm men tự do đạt cực đại trễ hơn, sau 36h lên men. Tương tự như vậy, nấm men cố định cũng đạt được giá trị tốc độ sử dụng đường riêng cực đại nhanh hơn nhiều so với nấm men tự do (12h so với 36h) (Hình 4.6).
Hình 4.33: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Điều đĩ cho thấy nấm men cố định cĩ khả năng sử dụng đường nhanh hơn và triệt để hơn so với nấm men tự do, hay nĩi cách khác, khả năng trao đổi chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Ngồi nguyên nhân là nấm men cố định cĩ khả năng chịu được áp suất thẩm thấu cao như trong phần 4.1.1 đã giải thích, nguyên nhân của hiện