2.1. Giữ giống và nhân giống
* Giữ giống: các chủng sau khi lựa chọn được giữ giống trên mơi trường
khống Gost bổ sung dầu DO, giữ trong glycerin với tỉ lệ 1:1, và trên mơi
trường hiếu khí thạch nghiêng.
Nhân giống: chủng được nhân giống trên mơi trường hiếu khí thạch
nghiêng, rồi từ đĩ được cấy sang mơi trường Gost cĩ bổ xung 5% dầu DO để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2. Tuyển chọn các chủng cĩ khả năng sử dụng dầu mạnh
Các chủng sau khi phân lập từ mùn khoan dầu khí được nhân giống và và cấy chuyền ra các ống thạch nghiêng.
Tiến hành nuơi lắc từng chủng trên mơi trường Gost 1% NaCl chứa 5% dầu
DO, pH =7,5; tốc độ lắc v =200vịng/phút với tỉ lệ 1% giống, theo dõi trong một
tuần. Quan sát sự thay đổi độ đục, trạng thái của dầu trong mơi trường, kết luận
chủng cĩ khả năng sử dụng dầu hay khơng. Nếu mơi trường cĩ độ đục cao, dầu
bị nhũ hố thì chứng tỏ chủng cĩ khả năng sử dụng dầu mạnh.
2.3. Quan sát hình thái
2.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc: cấy ria các chủng trên mơi trường
hiếu khí, ủ ở điều kiện 30oC sau 24h đem quan sát.
2.3.2. Quan sát hình thái tế bào: sau24h nuơi cấy, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học.
dịch KOH 3% lên sinh khối tế bào, dùng que cấy đánh tan tế bào. Nếu dịch tạo
nhớt thì kết luận vi khuẩn thuộc nhĩm Gram âm, nếu khơng tạo nhớt chứng tỏ vi
khuẩn là Gram dương
* Xác định khả năng chuyển động: làm tiêu bản giọt ép và soi kính hiển vi.
2.4. Xác định các đặc điểm sinh hố bằng các phép thử hố sinh: nhằm
mục đích xác định khả năng sử dụng một số các cơ chất của chủng nghiên cứu.
2.5. Xác định số lượng tế bào trên mơi trường thạch (phương pháp
Koch)
Pha lỗng dịch theo dãy thập phân: Chuẩn bị một loạt các lọ penicilin
chứa 4,5 ml muối sinh lí vơ trùng, hút 0,5 ml dịch cần pha loãng vào lọ penicilin
thứ nhất và lắc đều, từ lọ thứ nhất chuyển 0,5 ml sang lọ penicilin thứ hai, cứ
thực hiện liên tiếp như vậy cho đến độ pha loãng thích hợp.
Sau khi pha lỗng hút 0,1ml dịch ở độ pha loãng thích hợp vào đĩa chứa mơi trường hiếu khí, dùng que trang gạt đều. Trong quá trình pha lỗng tiến (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hành với hai độ pha loãng chẵn hoặc lẻ liên tiếp thích hợp, ở mỗi độ pha loãng
hút vào hai đĩa peptri để giảm sai số, nuơi ở nhiệt độ 300C sau 1-2 ngày đem xác định số lượng tế bào.
Cơng thức tính số lượng tế bào:
X = n * 10 (x+1)
Trong đĩ: X là số lượng tế bào trong 1ml dịch cần xác định.
n là số lượng tế bào trung bình các đĩa
x là sốthứ tự của lọ pha loãng
2.6. Đánh giá khả năng sinh CHHBM theo phương pháp Pruthi
Khả năng sinh CHHBM được đánh giá thơng qua chỉ sĩ nhũ hố E24
Chỉ số nhũ hố E24 đặc trưng cho khả năng nhũ hố của các sản phẩm trao đổi chất do vi sinh vật sinh ra trong dung mơi xylen sau 24h trong 4oC.
Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch nuơi cấy đã ly tâm loại bỏ tế bào thêm 1 ml xylen vào ống nghiệm đem voltex trong 1 phút với vận tốc 2000 vịng/phút.
Mẫu được giữ ở 4oC trong 24h rồi đem đo.
Chiều cao cột nhũ hố
E24 = x100% Chiều cao tổng số
E24 càng cao thì khả năng nhũ hố của sản phẩm càng lớn.
2.7. Tối ưu hố một số các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo CHHBM theo phương pháp Gause- Zenden
Phương pháp Gause-Zenden là phương pháp tối ưu đơn giản, được tiến
hành bằng cách chỉ thay đổi một yếu tố tác động, cố định các yếu tố tác động
cịn lại. Quá trình A chịu ảnh hưởng của n yếu tố, chỉ số cần tối ưu là y.
Cố định (n- 1) yếu tố và cho một yếu tố thay đổi trong khoảng xác định
cơng nghệ của nĩ, ứng với mỗi một thí nghiệm ta xác định được một số liệu y.
Trong dãy số liệu thu được ta xác định được một giá trị y tối ưu. Ta thu được
loạt thí nghiệm thứ nhất.
Loạt thí nghiệm thứ 2 ta cũng cố định (n-1) yếu tố tác động ở một giá trị nào đĩ, cho yếu tố thứ n thay đổi trong khoảng xác định cơng nghệ. Trong dãy thí nghiện thu được ta được một giá trị tối ưu của yếu tố thứ 2.
Thực hiện n loạt thí nghiệm như vậy ta xác định đựoc các giá trị tối ưu của
các yếu tố tác động mà tại đĩ y tối ưu.
Phương pháp này chỉ tiệm cận tới vùng tối ưu.
Trong phạm vi khố luận này, chỉ số cần tối ưu là sản lượng CHHBM, các
yếu tố tác động là nhiệt độ, pH, nồng độ muối và nguồn cacbon.
2.8. Phân tích sản phẩm bằng phổ hồng ngoại (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấu trúc phân tử của chất hoạt hố bề mặt được nghiên cứu bằng phương
pháp phân tích phổ hồng ngoại nhờ sự giúp đỡ của phịng phổ hồng ngoại –Viện
Cơng nghệ hố học để dự đốn cấu trúc hố học của sản phẩm.
2.9. Xác định trọng lượng khơ của CHHBM
Phương pháp tách chiết chất hoạt hố bề mặt được tiến hành theo phương
Dịch nuơi cấy
Li tâm 8.000 v/ph 10’
Dịch huyền phù Cặn
Bổ sung axeton tỉ lệ 1:4 giữ ở 4oC trong 24h
Li tâm Chất kết tủa Dịch nuơi cấy và axeton
Làm khơ chân khơng
Chất hoạt hố bề mặt
Trọng lượng của CHHBMSH được đo bằng cân phân tích.
2.10. Xác định độ bền hoạt tính của CHHBM
Dịch nuơi cấy được li tâm 20.000 vịng/phút trong thời gian 10 phút để loại
bỏ toàn bộ tế bào, thu phần dịch chứa CHHBM.
Phần dịch thu được đặt ở các nhiêt độ 30oC, 55oC trong thời gian 3 ngày, 10 ngày, 15 ngày và ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút, 60 phút; rồi đem đo hoạt tính để đánh giá độ bền của CHHBMSH.
2.11. Đánh giá ảnh hưởng của CHHBMSH lên mùn khoan
* Làm giàu vi khuẩn phân huỷ saralin trong mùn khoan:
Cân 10 gam mùn khoan cho vào bình 250ml chứa mơi trường Gost cĩ bổ
sung 5% dầu saralin, tiến hành lắc trong 3 ngày. Sau đĩ cấy chuyển 2ml dịch nuơi lắc sang bình khống Gost thứ hai cũng bổ sung 5% dầu saralin, lắc trong 5
ngày. Hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu được dùng làm giống.
* Bổ sung CHHBMSH để làm tăng khả năng phân huỷ dầu:
Nuơi cấy chủng M150 để thu được lượng CHHBM cực đại.
Thu CHHBM bằng cách li tâm loại bỏ tế bào, thu dịch nuơi cấy.
Chuẩn bị 4 bình khống Gost chứa 5% saralin, bổ sung vào các bình 0,5ml dịch hỗn hợp vi khuẩn phân huỷ dầu.
Bổ sung CHHBMSH vào một bình 1ml, bình 2ml, bình 3ml và một bình khơng bổ sung CHHBM.
Đếm số lượng vi sinh vật lúc mới bổ sung và sau khi lắc 4 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sự ảnh hưởng của CHHBM lên vi sinh vật trong mùn khoan thơng qua sự
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN