- Kỹ thuật MS/MS
Chơng 4: Bàn luận.
4.1. Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI.
4.1.1. Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang. dung dịch bằng HPLC với dertecter huỳnh quang.
*Về Xây dựng phơng pháp:
Thiết lập đợc các điều kiện chạy sắc ký, khảo sát một số điều kiện tạo dẫn xuất huỳnh quang nh: nhiệt độ, thời gian.
*Về thẩm định phơng pháp:
Quá trình thẩm định phơng pháp định lợng đã đợc nêu chi tiết tại mục 3.2.3 với kết quả nh sau:
- Phơng pháp có tính chọn lọc tốt.
- Hệ thống có tính phù hợp cao do có độ lệch chuẩn tơng đối của các thông số phân tích đều nhỏ hơn 3% khi tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trên cùng một mẫu chuẩn.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,5àg/ml- 10àm/ml. Có sự tơng quan chặt
giữa tỷ số diện tích pic (AZI/CLA).
- LOQ là 0,5 àg/ml không phù hợp để tiến hành xây dựng quy trình định
lợng AZI trong HT, vì để định lơng AZI trong HT đòi hỏi phơng pháp có LOQ thấp hơn (ng/ml).
Với giới hạn định lợng và khoảng tuyến tính trên thì phơng pháp này có thể áp dụng để định lợng AZI trong các chế phẩm.
4.1.2. Về xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng AZI trong HT bằng LC-MS. HT bằng LC-MS.
*Về Xây dựng phơng pháp:
- Phơng pháp xử lý mẫu: để tạo điều kiện tối u cho định lợng AZI trong HT ngời (có nồng độ thấp, nền mẫu phức tạp) đạt kết quả tốt, quy trình xử lý mẫu phải có khả năng loại tạp tốt và hiệu suất chiết cao. Chúng tôi lựa chọn phơng pháp chiết lỏng - lỏng để tách AZI trong HT nhằm giảm chi phí cho quá trình phân tích, ngoài ra chiết lỏng - lỏng cũng không đòi hỏi các trang thiết bị đặc biệt, quá trình tiến hành đơn giản, dễ triển khai.
Chiết lỏng - lỏng sử dụng dung môi hữu cơ còn có khả năng làm giàu mẫu do quá trình bay hơi dung môi (cô đặc mẫu). Tuy nhiên, trong quá trình bay hơi dung môi, để tránh AZI có thể bị phân hủy bởi nhiệt độ, nên khi bay
hơi dung môi không để nhiệt độ cao ( nhỏ hơn 50oC).
- Phơng pháp LC-MS định lợng AZI trong HT: phơng pháp LC-MS để định lợng AZI trong dịch sinh học đã đợc nghiên cứu và công bố trong một số tài liệu[12],[13]. Dựa vào các tài liệu đã công bố, kết hợp với các điều kiện khách quan phù hợp chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký. Kết quả đánh giá thông qua xác định tính chọn lọc, tính phù hợp của hệ thống, khoảng nồng độ đáp tuyến tính, hàm đáp ứng, tính đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết.
Qua các kết quả thu đợc, chúng tôi nhận thấy chơng trình đợc xây dụng và đã sử dụng trong đề tài là phù hợp để phân tích định lợng AZI trong HT ng- ời. Pic AZI có thời gian lu ngắn (khoảng 3 phút), tách riêng biệt khỏi pic của
nội chuẩn (khoảng 6 phút), pic cân đối, gọn, với thời gian sắc ký phù hợp (8,5
phút).
* Về thẩm định phơng pháp định lợng.
Sau khi xây dựng xong một quy trình phân tích, để đảm bảo có thể áp dụng quy trình vào phân tích trong thực tế một cách chính xác, cần thẩm định
lại phơng pháp với đầy đủ các chỉ tiêu nh: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lợng, độ đúng, độ chính xác, độ ổn định của mẫu phân tích.
Quá trình thẩm định phơng pháp định lợng đã đợc nêu chi tiết tại mục 3.3.4 với kết quả nh sau:
*Phơng pháp có tính chon lọc cao.
LC-MS là một trong những thiết bị phân tích có tính chọn lọc và độ nhạy cao nhất hiện nay. Xây dụng phơng pháp bằng LC-MS đảm bảo tốt đợc tính chọn lọc và độ nhạy nhng hạn chế là thiết bị cha đợc trang bị rộng rãi tại các trung tâm kiểm nghiệm, hiện tại chỉ có tại các trung tâm kiểm nghiệm đầu ngành do đó triển khai ứng dụng các phơng pháp phân tích trên LC-MS trong ngành Y, Dợc còn rất hạn chế.
* Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,02μg/ml - 2μg/ml.
Hệ số tơng quan lớn hơn 0,99 (R2 = 0,9966) là chấp nhận đợc cho định
lợng trong dịch sinh học ở nồng độ thấp. Khoảng nồng độ tuyến tính thu đợc phù hợp để định lợng AZI trong HT ngời sử dụng AZI (uống 2 viên Zithromax
250mg Cmax= 332,08 90,12 ng/ml, T± max= 2,82 1,11 h [16].)±
* Giới hạn định lợng: LOQ= 0,02μg/ml
Trong đề tài này, giới hạn định lợng đợc xác định theo tỷ số S/N. Giới hạn định lợng này là phù hợp để định lợng AZI trong huyết tơng phục vụ nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học
* Độ đúng
Phơng pháp nghiên cứu có độ đúng cao với giá trị biến thiên từ 94,05% -
104,29%, độ lệch nằm trong giới hạn cho phép ( 15%).±
Nh vậy, theo tài liệu [19], phơng pháp định lợng của đề tài nghiên cứu đạt tiêu chuẩn về độ đúng cho phơng pháp phân tích các dịch sinh học và có thể áp dụng để định lợng AZI trong HT ngời.
* Độ chính xác:
Trong đề tài chúng tôi tiến hành thẩm định độ chính xác theo tiêu chí độ lặp lại trong ngày và kết quả cho thấy đối với độ lặp lại trong ngày, các giá trị RSD biến thiên từ 2,24% - 7,29% (< 10%), vậy phơng pháp phân tích đợc xây dựng trong đề tài đạt tiêu chuẩn về độ chính xác cho phơng pháp phân tích các dịch sinh học [19], và có độ chính xác trung bình.
* Độ ổn định: Do điều kiện khách quan là không chủ động đợc thời
gian cũng nh lịch trình sử dụng thiết bị (LC-MS) nên chúng tôi cha thực hiện đánh giá độ ổn định của AZI trong thời gian phân tích và trong thời gian bảo quản.
4.2. Về kết quả định lợng thăm dò AZI trong HT ngời tình nguyện.
Định lợng thăm dò trên 2 ngời tình nguyện uống viên nén Zithromax
liều 500mg sau bữa ăn 2 giờ, đo đợc nồng độ AZI trong HT tại thời điểm sau uống thuốc 1 giờ là: 0,048μg/ml và 0,052μg/ml; tại thời điểm sau uống thuốc 1,75 giờ là: 0,195μg/ml và 0,211μg/ml
Vậy chúng tôi khẳng định phơng pháp đã đợc xây dựng định lợng đợc AZI trong HT. Có thể dùng phơng pháp này để định lợng AZI trong HT ngời dùng thuốc phục vụ công tác điều trị, nghiên cứu sinh khả dụng và tơng đơng sinh học.