II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. Phương pháp thí nghiệm
2.3. Thí nghiệm 3 Khảo sát khả năng kích kháng bệnh sọc lá
trên khía cạnh mô học
2.3.1. Bố trí thí nghiệm
- Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới và phòng thí nghiệm; bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên; gồm 4 nghiệm thức và 4 lần lặp lại.
Nghiệm thức 1 (NT1): xử lý bằng acibenzolar - S - metyl (100 ppm) Nghiệm thức 2 (NT2): xử lý bằng K2HPO4 (100 mM)
Nghiệm thức 3 (NT3): xử lý bằng salicylic acid (7,5 mM)
* Sơđồ bố trí thí nghiệm TN2 TN3 TN1 TN2 TN1 TN4 TN2 TN3 TN4 TN4 TN3 TN1 TN2 TN1 TN4 TN3 2.3.2. Cách tiến hành thí nghiệm
- Xử lý kích kháng: Xử lý chất kích kháng bằng cách phun khi cây bắp có 2 lá thật với các hóa chất ở các nồng độ đã nêu trên. Nghiệm thức đối chứng được xử lý bằng nước cất thanh trùng.
- Chuẩn bị bắp phun nấm tấn công: Khi cây bắp có 3 lá hoàn chỉnh, chuyển bắp vào phòng chủng bệnh, cốđịnh lá bắp trước khi phun nấm. Trên mỗi chậu, chọn các lá thứ 3 nở hoàn toàn, trãi lá lên bề mặt bảng nhựa và dùng dây cotton cốđịnh ở 2 vị trí (Hình 3).
- Nguồn nấm bệnh và lây nhiễm: giống thí nghiệm 1 - Cách thu mẫu và xử lý mẫu
Thu mẫu vào thời điểm 12; 24 và 48 giờ sau khi phun nấm lây nhiễm. Lá bắp thứ ba của cây được cắt cho vào đĩa petri có lót giấy thấm chứa 3 ml dung dịch ethanol – acid acetic (tỉ lệ 3 : 1) để tẩy diệp lục tố của lá (de Neergaard, 1997). Thay giấy thấm và dung dịch ethanol – acid acetic mỗi ngày cho đến khi mẫu lá không còn màu xanh của diệp lục tố. Sau đó chuyển sang nước cất trong một giờ. Cuối cùng giữ mẫu trong dung dịch lactoglycerol (acid lactic + glycerol + nước cất với tỉ lệ 1 : 1 : 1) cho đến khi quan sát (Tran Thi Thu Thuy, 2002) (Hình 4).
- Cách quan sát và ghi nhận chỉ tiêu:
+ Cách quan sát: quan sát bằng cách nhuộm lá với dung dịch aniline blue (0,01%) và xem dưới kính hiển vi. Trên mỗi lần lặp lại của 1 nghiệm thức quan sát ngẫu nhiên 100 bào tửđể quan sát khả năng nảy mầm, sốống mầm tạo ra, chiều dài ống mầm, khả năng phân nhánh của ống mầm và khả năng tạo đĩa áp của bào tử.
+ Các chỉ tiêu ghi nhận:
• Số lượng bào tử nảy mầm;
• Số lượng bào tử có nhiều ống mầm; • Số lượng bào tử có ống mầm phân nhánh; • Chiều dài của ống mầm;
Hình 3. Cách cốđịnh lá bắp trên bảng nhựa trước khi lây nhiễm bệnh
A B
Hình 4. Mẫu lá trước khi tẩy diệp lục tố (A) và sau khi tẩy diệp lục tố (B)
+ Các thông số cần tính: Số bào tử nảy mầm Tỉ lệ bào tử nảy mầm = Số bào tử quan sát x 100 Số bào tử tạo ra trên 1 ống mầm Tỉ lệ bào tử tạo nhiều ống mầm = Số bào tử nảy mầm x 100 Số bào tử tạo ống mầm phân nhánh Tỉ lệ bào tử tạo ống mầm phân nhánh = Số lượng bào tử nảy mầm x 100 Số bào tử tạo đĩa áp Tỉ lệ bào tử tạo đĩa áp = Số bào tử quan sát x 100 2.4. Xử lý số liệu
Số liệu về các chỉ tiêu theo dõi được quản lý bởi phần mềm Excel và xử lý thống kê theo phần mềm SPSS 13.
CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CÁC NỒNG ĐỘ HÓA CHẤT CÓ KHẢ NĂNG HẠN CHẾ BỆNH SỌC TRẮNG LÁ TRÊN BẮP HẠN CHẾ BỆNH SỌC TRẮNG LÁ TRÊN BẮP
Sau khi phun nấm lây nhiễm bệnh khoảng 5 - 7 ngày, vào thời điểm sáng sớm, khi có sương mù, ở mặt dưới lá xuất hiện lớp phấn mỏng màu trắng mịn. Tuy nhiên, vào lúc này bệnh vẫn chưa thể hiện triệu chứng (lá bắp vẫn có màu xanh đều). Đến sau 7 NSP, triệu chứng bệnh trên lá mới bắt đầu thể hiện ở các nghiệm thức với những vết màu trắng mờ, loang lỗ dọc theo 2 bên gân lá. Do đó, đến 8 NSP, chúng tôi tiến hành lấy chỉ tiêu thí nghiệm đầu tiên.
Tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh, hiệu quả giảm bệnh là những chỉ tiêu quan trọng đểđánh giá khả năng hạn chế bệnh của một loại hóa chất. Các chỉ tiêu thí nghiệm được ghi nhận ở các thời điểm 8; 16 và 24 NSP. Kết quả thí nghiệm thu nhận được trình bày ở các bảng 3; 4 và 5.
1. Khả năng hạn chế bệnh khi xử lý với các hóa chất ở thời điểm 8 ngày sau khi phun nấm lây nhiễm khi phun nấm lây nhiễm
Ở thời điểm 8 NSP, nhìn chung ở giai đoạn này cây ở các nghiệm thức đã có 5 lá hoàn chỉnh, nhưng triệu chứng bệnh chỉ thể hiện tương đối rõ ở lá thứ nhất, thứ hai và thứ ba -là những lá có phun nấm lây nhiễm bệnh. Triệu chứng bệnh ở thời điểm này là những vết loang lỗ màu trắng mờ với lớp phấn mỏng tại vị trí vết bệnh ở mặt sau lá vào buổi sáng; lá thứ tư và thứ năm của các cây thí nghiệm hầu như chưa thể hiện triệu chứng bệnh ở mặt trên lá trừ một số ít lá thứ tư có lớp phấn mỏng màu trắng mờở mặt sau tại vị trí chóp lá. Ở giai đoạn này, chỉ tiêu về mức độ bệnh được ghi nhận ở các lá thứ 3; 4; 5 (những lá không được phun hóa chất xử lý) để khảo sát hiệu quả kích kháng lưu dẫn của các hóa chất. Do đó, ở thời điểm này, tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh ở các nghiệm thức còn thấp (đặc biệt ở các nghiệm thức có xử lý hóa chất), triệu chứng bệnh thể hiện mờ nên không ghi nhận được hình ảnh thể hiện sự khác biệt về mức độ bệnh ở các nghiệm thức vào thời điểm này. Kết quả ghi nhận mức độ bệnh ở thời điểm này được trình bày ở Bảng 3.
Xét về giá trị tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh và chỉ số bệnh, kết quả ở Bảng 2 cho thấy, nghiệm thức xử lý với acibenzolar-S-methyl (100 ppm) có tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh và chỉ số bệnh lần lượt là 5,3% và 3,1 thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng. Tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh; chỉ số bệnh của các nghiệm thức xử lý với K2HPO4 ở nồng độ 100 mM và salicylic acid ở nồng độ 7,5 mM lần lượt là 7,5%; 4,2 và 6,7%; 4,3 không sai khác với tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh của nghiệm thức xử lý bằng acibenzolar-S-methyl ở nồng độ 100 ppm.
Chỉ tiêu quan trọng hơn nữa thể hiện khả năng hạn chế bệnh trên cây của các hóa chất thí nghiệm là hiệu quả giảm bệnh. Ở đây, hiệu quả giảm bệnh được đánh giá qua so sánh tỉ lệ diện tích lá bị nhiễm bệnh giữa các nghiệm thức có xử lý hóa chất với nghiệm thức đối chứng.
Kết quả ghi nhận hiệu quả giảm bệnh ở Bảng 2 cho thấy ở 8 NSP, nghiệm thức xử lý bằng acibenzolar-S-methyl (100 ppm) và xử lý bằng salicylic acid (7,5 mM) có hiệu quả giảm bệnh cao nhất, lần lượt là 73,5% và 66,2%, cao hơn nghiệm thức đối chứng không xử lý một cách có ý nghĩa thống kê. Các hóa chất và nồng độ xử lý kích kháng cho hiệu quả cao tiếp theo là K2HPO4 (100 mM) có hiệu quả giảm bệnh là 61,5%; salicylic acid (5 mM) có hiệu quả giảm bệnh là 59,9%. Các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức xử lý với salicylic acid (10 mM)) đều có hiệu quả cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng.
Bảng 2. Khả năng hạn chế bệnh của các hóa chất ở thời điểm 8 ngày sau khi phun nấm lây nhiễm Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ Tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh (%) Hilệệ bu quệnh (%) (1) ả giảm tỉ Chỉ số bệnh BTH 50 ppm 12,2 bcd 37,9 bcd 7,4 abc 100 ppm 5,3 e 73,5 a 3,1 e 200 ppm 13,6 bc 30,9 cd 6,6 bcd K2HPO4 20 mM 12,8 bcd 34,7 bcd 7,0 bc 50 mM 14,6 bc 25,8 cd 7,6 abc 100 mM 7,5 de 61,5 ab 4,2 de Salicylic acid 5 mM 8,0 de 59,9 ab 5,0 cde
7,5 mM 6,7 e 66,2 a 4,3 de 10 mM 15,9 ab 19,1 de 8,1 abc Đối chứng 19,7 a 0,0 e 9,9 a
CV(%) 34,43 22,56 30,99
Trong cùng một cột, các trung bình có cùng mẫu tự theo sau không khác biệt ở mức ý nghĩa α = 5% qua phép thử Duncan.
(1) Số liệu được chuyển sang arcsin√X% khi xử lý thống kê.
Thông qua hai tiêu chí đánh giá hiệu quả hạn chế bệnh của các hóa chất ở 8 NSP (Bảng 2), nồng độ hóa chất có hiệu quả hạn chế bệnh sọc trắng lá bắp cao nhất là acibenzolar- S-methyl ở nồng độ 100 ppm. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu trước cho rằng xử lý acibenzolar-S-methyl có khả năng kích thích cây bắp kháng lại với bệnh sương mai do nấm Peronosclerospora sorghi thông qua cơ chế kích thích làm tăng hoạt tính của PR-1 và PR-5 của cây (Morris et al., 1998). Kết quả nghiên cứu của Bécot et al. (2000) cho thấy khi xử lý bằng cách phun acibenzolar-S-methyl lên cây bông cải cũng cho hiệu quả kích thích cây kháng lại với bệnh sương mai. Nghiên cứu khác trên cây lúa cũng cho thấy xử lý acibenzolar-S-methyl làm giảm 68,4% tỉ lệ diện tích lá
nhiễm bệnh cháy lá do nấm Pyricularia grisea thông qua việc kích thích làm gia tăng hoạt tính của enzyme catalase và peroxidase (Ngô Thành Trí et al., 2003).
Cũng thông qua kết quả bảng 2 ở 8 NSP chất có hiệu quả hạn chế bệnh sọc trắng lá bắp cao tiếp theo là salicylic acid (7,5 mM) và K2HPO4 (100mM). Hiệu quả giảm bệnh của việc xử lý K2HPO4 ởđây cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Chaluvaraju et al.
(2004) cho thấy xử lý phun K2HPO4 (100 mM) lên lá có khả năng làm giảm bệnh sương mai trên bắp. Hiệu quả cho khả năng hạn chế bệnh cao của salicylic acid trên cây bắp ở nghiên cứu này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của Morris et al.
(1998) cho rằng xử lý salicylic acid trên bắp có khả năng kích thích cây bắp kháng lại với sương mai thông qua cơ chế kích thích làm tăng hoạt tính của PR-1 và PR-5 của cây; tuy nhiên tác giả cũng cho rằng hiệu quả kích kháng của xử lý salicylic acid không cao bằng xử lý với acibenzolar-S-methyl. Trên đối tượng cây dưa leo, kết quả nghiên cứu cho thấy xử lý salicylic acid ở nồng độ 4 mM có khả năng kích thích dưa leo kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium (Lê Thanh Toàn, 2006). Theo Nguyễn Thị Khánh Vân (2008), salicylic acid rất có hiệu quả kích thích cây ớt kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra. Cũng trên đối tượng nấm Colletotrichum,
nghiên cứu của của Trần Thị Thu Thủy et al. (2006b) cho thấy salicylic acid ở nồng độ 7,5 mM có khả năng kích thích cây cà chua kháng lại với bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum.
Các nồng độ của các hóa chất khác có hiệu quả tương đối cao, nhìn chung có khác biệt và cao hơn so với nghiệm thức không xử lý được sử dụng làm đối chứng một cách có ý nghĩa thống kê. Theo Phạm Văn Kim (2002), hiệu quả giảm bệnh được chấp nhận khi giảm bệnh từ 50% trở lên. Điều đó chứng tỏ ở thời điểm 8 NSP các hóa chất acibenzolar-S-methyl ở nồng độ 100 ppm; salicylic acid ở nồng độ 5 và 7,5 mM và K2HPO4ở nồng độ 100 mM rất có hiệu quả trong việc kích thích cây bắp kháng lại với bệnh sọc lá do nấm Peronosclerospora maydis gây ra.
Nói tóm lại, ở thời điểm 8 NSP, các hóa chất và nồng độ cho tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh thấp và hiệu quả giảm bệnh cao trên 50% là: acibenzolar-S-methyl (100 ppm); salicylic acid (5 và 7,5 mM) và K2HPO4 (100 mM).
2. Khả năng hạn chế bệnh khi xử lý với các hóa chất ở thời điểm 16 ngày sau khi phun nấm lây nhiễm khi phun nấm lây nhiễm
Đến thời điểm 16 NSP, nhìn chung đa số cây ở các nghiệm thức đã thể hiện triệu chứng bệnh lưu dẫn, nên tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh của các nghiệm thức đạt cao hơn so với thời điểm 8 NSP. Ở những cây nhiễm bệnh nặng, triệu chứng bệnh của những lá mới ra thể hiện ngay cả ởđầu lá (không thể hiện ở chóp lá như ở 8 NSP). Chỉ tiêu bệnh của các nghiệm thức ở 16 NSP thể hiện ở Bảng 3.
Xét về chỉ tiêu tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh, kết quả Bảng 3 cho thấy ở thời điểm 16 NSP tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh ở các nghiệm thức có xử lý hóa chất ít sai khác nhau. Nghiệm thức xử lý bằng salicylic acid ở nồng độ 7,5 mM và bằng K2HPO4ở nồng độ 100 mM có tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh thấp nhất lần lượt là 35,9% và 39,5% thấp hơn
một cách có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng có tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh là 75,3%.
Xét về chỉ tiêu chỉ số bệnh, ở 16 NSP nhìn chung chỉ số bệnh của các nghiệm thức không khác nhau nhiều và không sai khác nhiều so với đối chứng ngoại trừ chỉ số bệnh của nghiệm thức xử lý kích kháng bằng K2HPO4 (100 mM) và Salicylic acid (7,5 mM) đạt thấp nhất lần lượt là 17,4 và 17,3; thấp hơn nghiệm thức đối chứng một cách có ý nghĩa thống kê.
Ở thời điểm 16 NSP, khả năng hạn chế bệnh sọc trắng lá bắp của các hóa chất thông qua hiệu quả giảm bệnh ở Bảng 3 cho thấy hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức xử lý bằng salicylic acid (7,5 mM) và bằng K2HPO4 (100 mM) tương đối cao, lần lượt là 51,8% và 47,0% cao hơn một cách có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác và đặc biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh của nghiệm thức xử lý với salicylic acid (5 mM) là 41%, cao hơn nghiệm thức không xử lý một cách có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3. Khả năng hạn chế bệnh của các hóa chất ở thời điểm 16 ngày sau khi phun nấm lây nhiễm
Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ Tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh (%) Hiệu quả giảm tỉ lệ bệnh (%) (1) Chỉ số bệnh BTH 50 ppm 63,4 b 15,1 de 21,4 ab 100 ppm 57,2 b 23,3 cd 19,7 bcd 200 ppm 52,6 bc 29,0 bcd 21,1 ab K2HPO4 20 mM 60,4 b 19,6 cd 21,3 ab 50 mM 61,4 b 18,3 d 21,3 ab 100 mM 39,5 d 47,0 ab 17,4 de Salicylic acid 5 mM 44,2 cd 41,0 abc 18,5 cde
7,5 mM 35,9 d 51,8 a 17,3 e 10 mM 62,2 b 17,1 d 22,4 a Đối chứng 75,3 a 0,0 e 23,1 a
CV(%) 15,79 18,87 8,38
Trong cùng một cột, các trung bình có cùng m7ẫu tự theo sau không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan.
(1)Số liệu được chuyển sang arcsin√X% khi xử lý thống kê.
Kết quả Bảng 3 cho thấy ở thời điểm 16 NSP, hiệu quả giảm bệnh của các hóa chất không nhiều so với thời điểm 8 NSP. Hiệu quả giảm bệnh của các chất giảm nhiều theo thời gian, trong khi đó hiệu quả giảm bệnh của salicylic acid (7,5 mM) vẫn đạt trên
50%. Điều này chứng tỏ rằng, đến thời điểm 16 NSP khả năng hạn chế bệnh của việc xử lý có thểđã giảm hiệu lực.
Hiệu quả giảm bệnh của salicylic acid (7,5 mM) đạt cao trên 50% ở cả hai thời điểm 8 và 16 NSP. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trên đối tượng dưa leo của Trần Thị Thu Thủy et al. (2006a) cho rằng xử lý kích kháng bằng salicylic acid cho hiệu quả kích kháng kéo dài hơn một số hóa chất khác.
Tóm lại, trong 4 hóa chất ở các nồng độ thử nghiệm, salicylic acid (7,5 mM) cho hiệu quả giảm tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh cao trên 50% trong cả hai thời điểm 8 và 16 NSP.
3. Khả năng hạn chế bệnh khi xử lý với các hóa chất ở thời điểm 24 ngày sau khi phun nấm lây nhiễm khi phun nấm lây nhiễm
Đến thời điểm 24 NSP, các cây thí nghiệm đều thể hiện triệu chứng bệnh trên toàn cây. Bệnh thể hiện nặng ở gần như các nghiệm thức. Tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh, chỉ số bệnh và hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức được trình bày ở Bảng 4.
Kết quả Bảng 4 cho thấy đến thời điểm 24 NSP, nhìn chung tỉ lệ diện tích lá nhiễm bệnh và chỉ số bệnh của các nghiệm thức đều cao. Hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức không sai khác nhau, nghiệm thức có xử lý hóa chất không khác biệt ở mức có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức không xử lý. Kết quả này cho thấy, đến thời điểm 24 NSP hiệu quả hạn chế bệnh của việc xử lý hóa chất đã không còn hiệu lực.
Nói tóm lại, qua kết quả quan sát ở 3 thời điểm cho thấy hiệu quả giảm bệnh của việc