3. Phần 3: vật liệu, nội dung và phơng pháp nghiên cứu
3.2.6. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hởng việc xử lý giá thể đối với cây ra vờn ơm
vờn ơm
- CT1: Dớn+xơ dừa (1:1): không xử lý. - CT2: Dớn+ xơ dừa (1:1): có xử lý.
3.2.7. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hởng chế độ che đối với cây ra vờn - ơm.
- CT1: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và có che. - CT2: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che. - CT3: Dớn + xơ dứa (1:1 : có xử lý và có che.
- CT4: Dớn + xơ dứa (1:1) : không xử lý và không che.
3.2.8. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hởng của dinh dỡng đến sự sinh trởng và phát triển của cây và phát triển của cây
- CT1: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 ). - CT2: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 ).
- CT3: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K( 30: 10: 10 )+ vitamin+ vi lợng. - CT4: Phân tự chế với tỷ lệ N: P: K(20: 20: 20 )+ vitamin+ vi lợng.
3.3. Phơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Cách bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm trong phòng: Đợc bố trí tại phòng Công nghệ Sinh học- Viện Sinh học Nông nghiệp, Trờng Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội
- Số giờ chiếu sáng: 16- 18/ 24 giờ. - Cờng độ chiếu sáng: 2000- 3000 lux. - Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy: 25- 270C. - ẩm độ trong phòng nuôi cấy: 70%.
+ Thí nghiệm vờn ơm: Đơc bố trí trong điều kiện ánh sáng tán xạ và cây đợc t- ới dới dạng phun sơng.
- Toàn bộ thí nghiệm trong phòng và ngoài vờn ơm đều đợc bố trí ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, số cá thể/ lần lặp lại là 15- 20 cá thể.
- Số mẫu cấy ở mỗi lần lặp lại là: 5 mẫu cấy trên một lần lặp lại. Đánh giá thí nghiệm sau 8 tuần theo dõi.
- Số cây đợc trồng trên mỗi giá thể là 5 cây trên một lần lặp lại.
3.3.2. Phơng pháp tiến hành
Để thu đợc kết quả chúng tôi tiến hành làm ở các công thức thí nghiệm nh sau:
3.3.2.1. Phơng pháp gieo hạt
Mẫu thí nghiệm là quả địa lan đợc lấy từ vờn lan Hoàng liên cung cấp, mẫu lấy phải đảm bảo sạch bệnh và đầy đủ yêu cầu mong muốn. Sau khi chọn lựa mẫu đem rửa sạch bằng nớc máy, tiếp đó rửa bằng nớc xà phòng. Rồi đem mẫu đi khử trùng bằng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút + 1 phút, rồi tráng lại bằng nớc cất vô trùng. Mục đích tránh cho mẫu nhiễm hoá chất ngấm
sâu gây độc hại dẫn đến tình trạng mẫu chết trớc khi cấy vào môi trờng tái sinh. Sau đó ta gieo hạt trên các môi trờng có bổ sung nồng độ khoai tây khác nhau.
3.3.2.2. Cắt lớp mỏng tế bào
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng các thể protocorm tơng đối đồng đều nhau làm vật liệu và dùng dao vô trùng cắt các thể protocorm dới kính hiển vi thành các lát mỏng có kích thớc 0,3- 0,5 mm. Rồi sau đó cấy các lát mỏng đ- ợc cắt từ một thể protocorm vào môi trờng MS + 2% đờng + 0,68% agar có bổ sung kinetin. BA.
3.3.2.3. Tìm hiểu hệ số nhân của thể protocorm
Để tìm hiểu tác động của chất điều tiết sinh trởng, môi trờng đến hệ số nhân của thể protocorm. Chúng tôi đã tách các protocorm từ một cụm tơng đối đồng đều nhau để cấy trên cùng một nền môi trờng MS có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trởng( BA, kinetin ) ở các nồng độ khác nhau.
3.3.2.4. Quá trính tạo rễ
Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã dùng dao vô trùng tách các chồi có chiều cao từ 5,5- 6,5 cm từ một cụm chồi. Sau đó cắt bỏ hết các phần ở rễ cây. Cấy chồi đó trên môi trờng có bổ sung thêm các chất kích thích quá trình tạo rễ(than hoạt tính, α – NAA)
3.3.2.5. Phơng pháp xử lý giá thể, cách che sáng
Xơ dừa và dớn theo tỷ lệ 1: 1 đợc ngâm từ 2- 3 ngày rồi rửa sạch. Sau đó phối trộn với dung dịch thuốc nấm khuẩn, thuốc trừ sâu deterex+ dinh dỡng chuyên dùng cho lan của Trung Quốc (20: 20: 20). Để ngâm 1 ngày 1 đêm vớt ra, để ráo nớc đến độ ẩm nhất định (8%) và trống cây không tới nớc 3- 4 tuần
Che sáng: phủ giấy mỏng đến giảm ánh sáng và giảm bốc hơi nớc trong vòng 3- 4 tuần
Các chỉ tiêu theo dõi:
1. Tỷ lệ sống (%) = ∑ mẫu sống
∑ mẫu cấy ban đầu
2. Tỷ lệ tạo chồi (%) =
∑ chồi tạo ra
∑ thể protocorm tạo ra
x 100
3. Tỷ lệ tạo protocorm (%) = ∑ mẫu tạo protcorm
∑ mẫu sống
x 100
4. (%) số protocorm/lát cắt =
Mẫu tạo protcorm Tỷ lệ mẫu sống
x 100
5. Hệ số nhân = ∑ mẫu thu được
∑ mẫu cấy ban đầu 6. Tỷ lệ ra rễ (%) =
∑ cây ra rễ
∑ cây ban đầu
x 100 7. Số rễ trung bình/cây = ∑ số rễ ∑ số cây 8. Độ dài rễ trung bình = ∑ chiều dài rễ ∑ số rễ
9. Độ tăng chiều cao cây = chiều cao lần cuối – chiều cao lần đầu 10. Số lá mới trên cây = số lá lần cuối – số lá lần đầu
4. Phần 4: Kết quả và thảo luận4.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng 4.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng
Đây là giai đoạn đa đối tợng nuôi cấy từ điều kiện bình thờng vào điều kiện vô trùng trong ống nghiệm. Đối với tất cả các loại cây trồng khác nhau việc khử trùng thích hợp, có ý nghĩa quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in - vitro. Chúng tôi tiến hành khử trùng trên quả địa lan Hồng Hoàng, tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành khử trùng kép 7 phút + 1 phút. Sau đó cấy trên các nền môi trờng có bổ sung khoai tây ở các nồng độ 25g/ lít, 50g/ lít và 75g/ lít. Kết quả thí nghiệm đợc trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. ảnh hởng của việc bổ sung khoai tây vào môi trờng đến sự nảy mầm của hạt địa lan Hồng hoàng ( sau 8 tuần theo dõi )
Chỉ tiêu theo dõi
Sự biến đổi màu sắc, hình
thái Tỷ lệ nảy mầm sau 8 tuần 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần CT1(ĐC):VW + 100ml ND + 1% đ- ờng +0,1% pepton + 0,65% agar - - - - * CT2: ĐC + 25g khoai tây/ lít - - - + ** CT3: ĐC + 50g khoai tây/ lít - - + +++ **** CT4: ĐC + 75g khoai tây/lít - - + ++ ***
Ghi chú:
* : nảy mầm < 5% **: nảy mầm 50% ***: nảy mầm > 50% ****: nảy mầm 80 – 90%
-: cha xuất hiện mầu +: xuất hiện mầu xanh ++: mầu xanh ngọc +++: mầu xanh thẫm
Việc bổ sung khoai tây có ảnh hởng rõ rệt tới sự phát sinh hình thái, mầu sắc.
Sau 3 tuần ở CT2 và CT3 đã xuất hiện màu xanh. Sau 4 tuần CT3 đã xuất hiện màu xanh đậm hơn, trong khi đó CT1 cha có sự thay đổi màu sắc.
Sau 8 tuần theo dõi: ở các công thức đều có sự nảy mầm. Tỉ lệ nảy mầm, chất lợng mầm khác nhau rõ rệt, ở CT3 tỉ lệ nảy mầm cao nhất 80 – 90 % và chất lợng mầm khoẻ, tốt. Tỷ lệ nảy mầm thấp ở CT1 đạt khoảng 5%. Vì vậy sử dụng 50g khoai tây là tốt nhất.
4.2. Nghiên cứu nhân nhanh bằng phơng pháp cát lát mỏng
Cắt lát mỏng tế bào là phơng pháp đợc ứng dụng hiệu quả trong nhân giống vô tính in - vitro. Chúng tôi áp dụng phơng pháp này cho giống Hồng Hoàng, mục đích nhân nhanh đợc giống quý có chất lợng cao để đáp ứng thị tr- ờng. Có nhiều tác giả nghiên cứu ảnh hởng của kích thớc lát mỏng đến quá trình phát sinh hình thái lát cắt đặc biệt có nghiên cứu ảnh hởng kích thớc lát cắt trên cây phong lan, địa lan thơng mại tại Viện Sinh học Nông nghiệp - ĐHNNI đều có chung một kết quả, kích thớc lát mỏng thích hợp nhất cho quá trình phát sinh hình thái lát cắt có độ dày 0,3 – 0,5 mm. Vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng kích thớc lát cắt 0,3 – 0,5 mm và tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của kinetin, BA đến khả năng phát sinh hình thái lát cắt. Nguyên liệu sử dụng là các thể protocorm hoàn toàn sạch bệnh và đợc cắt theo lát cắt ngang. Sau đó cấy vào môi trờng MS + 2% đờng + 0,65% agar có bổ sung chất điều tiết sinh trởng BA, kinetin ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu đợc ở bảng 2, 3, đồ thị 1 và 2.
(sau 8 tuần nuôi cấy)
Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ mẫu hình thành thể protocorm(%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi(%) Hệ số nhân (số protocorm/lát mỏng) CT1(ĐC): MS +2% đờng +0,65% agar. 60,71 39,29 2,71 CT2: ĐC+ 0,3ppm BA 64,28 35,72 4,06 CT3: ĐC+ 0,5ppm BA 82,14 17,86 5,70 CT4: ĐC+ 1,0ppm BA 86,21 13,79 4,03 CT5: ĐC+ 1,5ppm BA 82,76 17,24 3,56 CT6: ĐC+ 2,0ppmBA 75,86 24,14 3,44 CT7: ĐC+ 3,0ppm BA 79,30 20,70 2,94 LSD(5%) 0,14 CV (%) 2,60 .
4.4 Nghiên cứu ảnh hởng nhóm Cytokinin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm trên giống hồng hoàng 2.71 4.06 5.7 4.03 3.56 3.44 2.94 0 1 2 3 4 5 6 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 công thức H ệ số n hâ n
Bảng 3. ảnh hởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy)
Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành(%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân protocorm/ lát mỏng (CT1)ĐC1: MS +2% đờng +0,65% agar. 57,14 42,86 2,62 CT2: ĐC+ 0,3ppm Kinetin 71,43 28,57 4,10 CT3: ĐC+ 0,5ppm Kinetin 82,14 17,68 4,62 CT4: ĐC+ 1,0ppm kinetin 87,57 21,43 6,26 CT5: ĐC+ 1,5ppm kinetin 85,71 14,29 4,32 CT6: ĐC+ 2,0ppm kinetin 75,00 25,00 4,11 CT7: ĐC+ 3,0ppm kinetin 67,86 31,14 3,89 LSD(5%) 0,12 CV (%) 1,90 2.62 4.1 4.62 6.26 4.32 4.11 3.89 0 1 2 3 4 5 6 7 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7 công thức Hệ s ố n hân
Từ kết quả bảng 2 và 3 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trởng vào môi trờng nuôi cấy đều có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái của lát mỏng, tỷ lệ mẫu tạo protocorm đều cao hơn đối chứng.
Bảng 2: Khi bổ sung BA với nồng độ 0,3- 3,0 ppm trên môi trờng MS +2% đờng + 0,65% agar, tỷ lệ protocorm cao nhất khi bổ sung 1,0 ppm BA, ở các nồng độ tiếp theo giảm dần, BA không chỉ cho thấy ảnh hởng rõ rệt của nó tới tỷ lệ lát cắt hình thành thể protorm mà còn cho thấy quy luật ảnh hởng của nó lên khả năng tạo thể protocorm của mỗi lát cắt, số lát cắt hình thành thể protocorm tỷ lệ thuận với protocorm đợc tạo ra.Tuy nhiên nếu ta vợt quá giới hạn nồng độ nhất định thì BA lại là tác nhân kìm hãm khả năng hình thành thể protocorm
Bảng 3: Khi bổ sung 0,3 – 1,0 kinetin thì tỷ lệ lát cắt hình thành thể protocorm tăng lên từ 2,62 – 6.26 lần, đờng biểu tác động của kinetin có dạng đờng cong một đỉnh, ở nồng độ 1,0 kinetin số protocorm trên lát cắt đạt giá trị cực đại. ở các nồng độ tiếp theo chỉ tiêu sẽ giảm dần nhng vẫn cao hơn đối chứng. Kết quả ở thí nghiệm cho phép chúng tôi xác định đợc môi trờng thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái của mẫu ban đầu là:
CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7
ảnh 3: ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy)
ảnh 2: ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái lát cắt (sau 8 tuần nuôi cấy)
MS + 15% ND + 2% đờng + 1,0 ppm BA (1,0 ppm kinetin) + 0,65% agar
4.3. Nghiên cứu ảnh hởng nhóm Cytokinin đến quả trình nhân nhanh thể protocorm
Thí nghiệm thuộc giai đoạn này nhằm tìm ra đợc môi trờng thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh thể protocorm. Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ vi nhân giống. Các protocorm tạo ra phải đồng nhất, các chồi tạo cây hoàn chình có tỉ lệ sống cao, phát triển mạnh, ít biến dị.
Kinetin và BA thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích tạo thể protocorm mạnh mẽ, đợc sử dụng trong các môi trờng nhân nhanh protocorm. Vì vậy kinetin, BA là những hợp chất không thể thay thế đợc trong quá trình nuôi cấy in - vitro. Để nghiên cứu ảnh hởng đến hệ số nhân giống địa lan bản địa trong ống nghiệm, chúng tôi tiến hành bổ sung kinetin, BA vào môi trờng nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Kết quả đợc trình bày ở bảng 4 và 5, đồ thị 3 và 4.
(sau 8 tuần nuôi cấy)
Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành(%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân (lần) ĐC: MS + 2% đờng + 0,65% agar 20,00 80,00 1,12 CT1: ĐC+ 0,3ppm BA 25,50 74,50 1,28 CT2: ĐC+ 0,5ppm BA 27,28 72,72 1,43 CT3: ĐC+ 0,7ppm BA 30,56 69,44 1,59 CT4: ĐC+ 1,0ppm BA 35,40 64,60 1,72 CT5: ĐC+ 1,5ppm BA 28,58 71,42 2,35 CT6: ĐC+ 2,0ppm BA 28,00 72,00 1,97 CT7: ĐC+ 3,0ppm BA 23,90 76,10 1,78 LSD(5%) 0,84 CV(%) 2,80
Bảng 5: ảnh hởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy)
Chỉ tiêu theo dõi Công thức Tỷ lệ protocorm hình thành (%) Tỷ lệ chồi hình thành (%) Hệ số nhân (lần) (CT1)ĐC: MS + 2% đờng + 0,65% agar 17,70 83,30 1,20 CT1: ĐC + 0,3ppm kinetin 21,90 78,10 1,28 CT2: ĐC + 0,5ppm kinetin 23,69 73,61 1,64 CT3: ĐC + 0,7ppm kinetin 26,20 73,80 1,77 CT4: ĐC + 1,0ppm kinetin 27,00 73,00 1,90 CT5: ĐC + 1,5ppm kinetin 30,50 69,50 2,16 CT6: ĐC + 2,0ppm kinetin 36,67 63,33 1,94 CT7: ĐC + 3,0ppm kinetin 20,60 79,40 1,60 LSD(5%) 0,94 CV (%) 3,10
Đồ thị 4: ảnh hởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh protocorm
Từ kết quả ở bảng 4 và 5 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trởng vào môi trờng nuôi cấy đều có khả năng kích thích tạo protocorm và chồi.
Kết quả bảng 4 cho thấy việc bổ sung BA vào môi trờng nuôi cấy đã làm tăng hệ số nhân so với đối chứng, hệ số nhân tăng từ (1,12 – 2,35 lần) và tỷ lệ thuận với nồng độ của BA bổ sung vào môi trờng từ nồng độ 0,3 – 1,5 ppm ở, cùng với sự tăng hệ số nhân thì tỷ lệ mẫu hình thành chồi cũng nh chất lợng chồi giảm. Qua theo dõi thí nghiệm ở nồng độ 2ppm BA trở lên đã xuất hiện các chồi nhỏ li ti biến dạng, không có khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh, do vậy không đợc coi là chồi hữu hiệu, chất lợng chồi kém. Việc tăng nồng độ là
ảnh 5: ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy)
ĐC CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6 CT 7
ảnh 4: ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh thể protocorm (sau 8 tuần nuôi cấy)
không cần thiết, vì BA làm tăng hệ số nhân thể protocorm, nhng lại kích thích chồi nách phát triển
Qua bảng 5 cho thấy, việc bổ sung kinetin cũng có qui luật tơng tự nh BA, ở nồng độ 1,5ppm cho hệ số nhân cao nhất (2,16 lần), sau đó chỉ tiêu này giảm và thấp nhất ở công thức đối chứng (1,20 lần). Nh vậy cho phép chúng tôi xác định đợc môi trờng nhân nhanh protocorm là:
MS + 2% đờng + 1,5ppm BA (1,5ppm kinetin) +0,65% agar
4.4. Nghiên cứu ảnh hởng của nớc dừa lên hệ số nhân và chất lợng của chồi
Nớc dừa là một hợp chất tự nhiên, đã đợc sử dụng vào nuôi cấy in -vitro từ những năm 1949, đợc ứng dụng khá rộng rãi tỏng các môi trờng nhân nhanh in - vitro: phong lan, dứa... Trong nớc dừa có chứa các axit amin, axit hữu cơ, đ- ờng, ARN, ADN. Đặc biệt trong nớc dừa có chứa những hợp chất có hoạt tính auxin, các glucoxit của cytokinin. Các thí nghiệm trong giai đoạn này nhằm tạo ra đợc môi trờng thích hợp cho quá trình nhân nhanh. Quyết định hiệu quả và tốc vi nhân giống. Giai đoạn này cần đạt hệ số nhân nhanh cao, chất lợng của chồi, cho hiệu quả, tiết kiệm thời gian, chi phí. Các chồi tạo ra đông nhất về mặt