Sau khi nuôi cấy lắc 4 giờ bắt đầu đo giá trị OD600 nm và kết hợp với đếm spot cuonting, chỉ chọn những nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25 – 300 để đếm. Nếu các khuẩn lạc mọc dày quá thì có thể đếm ½ hoặc ¼ giọt rồi nhân lên tƣơng ứng.
Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy.
(a) kết quả cấy vi khuẩn sau 5 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) kết quả cấy vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-1
, 10-2, 10-3 mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy.
(a) sau 7 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3
, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
Sau 4 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.06, giá trị này tƣơng đối thấp nên chúng tôi chỉ pha loãng và đếm số khuẩn lạc không ghi lại hình ảnh.
b a
Sau 5 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.14, với giá trị OD này chúng tôi pha loãng từ 100 – 10-6. Nhƣng chỉ chọn nồng độ pha loãng 10-1 để đếm, kết quả 3 lần lập lại nhƣ sau : 283, 298,252. Ở nồng độ này các khuẩn lạc mọc rất dày phải chia ra ½ giọt đếm. Tuy nhiên ở nồng độ pha loãng kế tiếp thì số khuẩn lạc mọc ít không đủ từ 25 – 300 khuẩn lạc.
Sau 6 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.36, chúng tôi pha loãng từ 10-1 đến 10-6 và chọn đếm ở độ pha loãng 10-2
, kết quả đếm của 3 lần lặp lại là : 109, 138, 143.
Sau 7 giờ nuôi cấy giá trị OD đạt đƣợc là 0.6, ở lần đếm này chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-7 để cấy lên đĩa và chọn ở nồng độ 10-3 để đếm, số khuẩn lạc đếm đƣợc nhƣ sau : 43, 52, 59.
Sau 8 giờ nuôi cấy giá trị OD đo đƣợc là 1.3, chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8
để cấy lên đĩa và chọn đếm ở độ pha loãng 10-5 kết quả là : 20,38, 47.
Khi giá trị OD đạt 1.3 thì dừng lại không theo dõi nữa vì thực tế chúng tôi chỉ cần biết trong điều kiện làm thí nghiệm này, để đạt đƣợc mật số tế bào 108 tế bào/ml thì giá trị OD tƣơng ứng sẽ là bao nhiêu.
Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
4 gờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.12 0.3 0.54 0.96 1.81 5 x 104 1.6 x 105 1.3 x 106 107 1.3 x 108 4.7 5.2 6.1 7 8.1
Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
4 giờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.06 0.14 0.36 0.6 1.3 105 3 X 105 1.3 X 106 5 X 106 3.5 X 108 5 5.5 6.1 6.7 8.6
Biểu đồ 4. 1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD.
Theo đƣờng tƣơng quan này chúng tôi nhận thấy mối tƣơng quan giữa hai giá trị khảo sát tƣơng đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tế bào là 108/ml tƣơng ứng với giá trị OD là 0.145-0.45, nhƣng theo chúng tôi để đạt đƣợc 108
tế bào/ml thì giá trị OD phải là 1.5-1.8. với so sánh này chúng tôi nghi ngờ đã có một lƣợng lớn tế bào bị chết khi pha loãng bằng nƣớc cất. Chúng tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm, sử dụng nƣớc muối sinh lý để pha loãng.
Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc muối sinh lý. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD.
Dựa vào đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật số tế bào ta thấy để đạt đƣợc mật số tế bào từ 5 x 107 – 108 tế bào/ ml thì ta nên chọn dịch nuôi cấy có giá trị OD từ 0.6 – 1, kết quả này khác biệt rất nhiều so với lần thí nghiệm thứ 1. Điều đó cho thấy khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí cho kết quả chính xác hơn khi pha loãng bằng nƣớc cất. So sánh giữa pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý và pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng có sự khác biệt rất lớn. Pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng số tế bào đếm đƣợc sẽ ít hơn khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý dù chúng có giá tri OD tƣơng đƣơng nhau. Kết quả này cho thấy khi dùng nƣớc cất vô trùng pha loãng sẽ có một số tế bào bị chết. Vì vậy, khi cần sự chính xác thì phải sử dung nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Và khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) vẫn có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này do nhiều nguyên nhân. Trong đó có hai nguyên nhân chính là chủng vi khuẩn và thiết bị đo OD.
Những điều cần lƣu ý
Do phải hút dịch vi khuẩn đang nuôi cấy để đo OD nhiều lần nên dịch nuôi cấy rất dễ bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài, phải cẩn thận khi thao tác.
Mật độ tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố sau Thể tích môi trƣờng nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lƣợng tế bào vi khuẩn cho vào ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy
Tốc độ của máy lắc
Vì vậy mặc dù mỗi lần xác định giá trị OD đều có các mốc thời điểm cụ thể, nhƣng không thể áp dụng các mốc thời điểm này để chuẩn bị khả nạp mà không cần xác định giá trị OD.