Thực hiện phản ứng blunt-end sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm của phản ứng blunt-end, và nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid ta đƣợc plasmid tái tổ hợp. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp, thu đƣợc kết quả
nhƣ sau
DC1 DC2 TS
(DC1) mẫu plasmid cắt bằng enzym EcoRV chưa tinh sạch, (DC2) mẫu plasmid cắt bằng enzym HindIII chưa tinh sạch, (TS) mẫu plasmid cắt bằng EcoRV được tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG.
(a) Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(b) một phần của hình ( a) được phóng to.
Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG.
(a)Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợpvới đoạn DNA 580bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37o
C.(b) một phần của hình a được phóng to.
a b
Với đoạn DNA có kých thƣớc 629bp, chỉ có 6 khuẩn lạc trắng trong tổng số 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc xanh là do sự tái đóng vòng của plasmid, các khuẩn lạc trắng có thể là do các tế bào mang plasmid tái tổ hợp. để khẳng định, chúng tôi tiến hành cấy chuyền, chiết tách plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thựic hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers T3, T7.
Với đoạn DNA có kých thƣớc 580bp, kết quả cho 4 khuẩn lạc trắng trong tổng số 108 khuẩn lạc, để kiểm tra các khuẩn lạc trắng này chúng tôi thực hiện cấy chuyền, tách chiết plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thực hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers ITS4, ITS5.