3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3.2. Tạo dẫn xuất:
Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn.
- Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng 2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào.
- Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1 khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng).
- Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực
hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng
pháp thổi khô với khí trơ. Nếu PITC không đƣợc loại thải tốt thì nó sẽ làm hƣ cũng nhƣ phá hủy cột HPLC.
- Mẫu đƣợc pha loãng trong 2 ml dung dịch pha loãng trong mẫu và đƣợc lọc qua bộ phận lọc đƣờng kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC.