2. TỔNG QUAN
2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation)
Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp.
Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong một lần phân tích).
Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg.
Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid.
Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài
ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn. Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm.
Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC) và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng amino acid với detector UV.
Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tƣơng ứng (response linearity) thu đƣợc từ 20 đến 500 pmol. Để thu đƣợc kết quả tốt, lƣợng mẫu lớn hơn 500 ng trƣớc khi thủy phân là tốt nhất.
Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng đƣợc sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa.
o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột)
Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột)
Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột)
7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột)