3.2.1 Hóa chất
3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel
Bio Gel – P100
Đệm photphat
3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE
Monomere solution (30,8% T; 2%Cbis)
4X Running Gel Buffer (1,5 M Tris HCl; pH 8,8)
4X Stacking Gel Buffer (0,5 M Tris HCl; pH 6,8)
SDS 10%
Ammonium Persulfate 10%
2X Treatment Buffer (0,125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% Bromophenol Blue; pH 6,8)
Tank Buffer (0,025 M Tris HCl; 0,1% SDS; 0,192 M Glycine; pH 8,3)
Thang protein chuẩn Low Range (19,8 – 108,5 kDa) (Bio–rad)
3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel
Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)
Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid)
3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting
Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS)
- Các dung dịch để phát hiện bằng miễn dịch
Phosphate buffer saline (PBS): 10mM sodium phosphate; 0,9% NaCl
Tween PBS (TPBS)
Tris buffer saline (TBS): 100mM Tris/HCl ; 0,9% NaCl
Blocking buffer: Tween tris buffer saline (TTBS); TTBS có 5% skim milk - Các dung dịch cho hệ thống sinh màu
Peroxidase assay buffer
DAB
CoCl2
Hydrogen peroxidase 30%
3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot
- Đệm rửa (A1): 10 mM Na2 H PO4; pH 7,2; 150 mM NaCl - Đệm rửa (A2): 0,05% Tween 20 trong dung dịch A 1 - Dung dịch Bloking (B): 1% casein trong dung dịch A 2
- Dung dịch cơ chất và thuốc nhuộm (DAB): DAB 0,01 % /0,03% H 2O2
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ
Bếp nhiệt khuấy từ IKAMAG
Bộ điện di nhỏ I Mudid
Bộ điện di SDS–PAGE và chuyển thẩm Power Pac Universal TM (Bio–rad)
Cân thường, cân phân tích
Máy sắc ký lọc gel (Bio–rad)
Máy lai HB–1000. Hybridize
Máy vortex VELP
Máy ly tâm thường Biofuge 13 (Heraus), máy ly tâm lạnh 4o
C (Bio–rad)
Tủ lạnh –20oC, 4oC
Thiết bị hút chân không
Tủ ấm 37oC
Máy lắc
Cốc becher, ống đong, ống nghiệm, pipet, các loại micropipet, tube eppendoft, tip các loại, kẹp, kéo…
3.2.3 Vật liệu 3.2.3.1 Kháng thể
- Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1).
- Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1).
- Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme Peroxidase (K2) (A 9046 – SIGMA)
3.2.3.1 Mẫu
Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9.
Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9
Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9.
Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng
Kí hiệu Nơi thu Nguồn
RTV-PmLA Long An Tôm sú RTV-PmLA (SLT) Long An Tôm sú RTV-PmCG Cần Giờ Tôm sú RTV-Pv M Chợ HCM Tôm TCT DTB Sf9 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp SDS–PAGE 3.3.1.1 Nguyên tắc
SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di protein đứng để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là:
Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (khác với lưới gel agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử đường bằng các cầu nối không đồng hoá
trị). Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và biacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học.
o Có hai tác nhân hóa học cần thiết đó là ammonium persulfate làm vai trò chất peroxide khởi động (initiator peroxide), và quaternary amine, N.N.N’.N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) làm chất xúc tác.
o Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động, và TEMED làm tác nhân xúc tác. Sự hình thành polyacrylamide để tạo lưới gel là một quá trình có sinh nhiệt. Do vậy, cần phải tối ưu hàm lượng tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình hoàn tất không nhanh quá, mà trong vòng 20 đến 60 phút là vừa.
Nhờ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hoạt động như một chất tẩy mà làm biến tính được protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, vì vậy đã tạo thành một lớp bọc điện tích âm chung quanh phân tử protein. Phân tử protein lúc này trở thành dạng que và mang điện tích âm nhiều hay ít tùy thuộc vào chiều dài (hay trọng lượng phân tử) của nó. Đây là động lực chính để các protein được phân giải theo trọng lượng phân tử của chúng khi điện di trong gel.
Có hai hệ thống điện di: Hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục. Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục. Hiện nay, SDS–PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), biến thể từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964).
Trong hệ thống này, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp. Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking gel. Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là running gel. Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), và lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel.
Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong running gel.
3.3.1.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di
1. Lắp ráp các khuôn đổ gel theo đúng sự hướng dẫn của nhà cung cấp. 2. Pha dung dịch running gel 12,5%.
3. Trong khi đợi running gel trùng hợp pha dung dịch stacking gel 4% acrylamide. Khi running gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp vào khuôn stacking gel cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lược vào, để yên 30 – 60 phút.
4. Sau khi stacking gel đã trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khỏi gel, tránh làm lệch gel giữa các răng lược. Rửa sạch các giếng gel bằng tank buffer. Ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng điện di. Chuẩn bị điện di.
B. Chuẩn bị mẫu để điện di
1. Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
2. Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong 2 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thí nghiệm.
3. Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel. Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn.
C. Thực hiện điện di
a) Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện. b) Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA.
c) Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch màu chạm đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất.
d) Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách gel ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting.
D. Nhuộm gel đã điện di
1. Cho gel vào khay nhuộm, đổ vào khay thuốc nhuộm Coomassie Blue cho ngập gel. Lắc đều và chậm trên máy lắc có xoay tròn (rotary shaker) trong 4 giờ hay qua đêm.
2. Thay thuốc nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I). Lắc tiếp trong 30 phút.
3. Thay dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I) bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II).
4. Giữ gel trong dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II) cho đến khi chụp hình hay làm khô gel. Để tránh cho gel khỏi bị nứt, thêm vào dung dịch glycero l 1%.
3.3.2 Phƣơng pháp Western Blot
3.3.2.1 Nguyên tắc
Western blotting và immunodetection là quá trình chuyển các band điện di từ gel SDS-PAGE sang màng nitrocelluse rồi sau đó dùng kháng thể đặc hiệu để phát hiện band protein đặc hiệu đã được chuyển lên màng.
Trong bước Western blotting, các band điện di từ gel được chuyển lên màng nitrocellulose bằng phương pháp sau:
Trong phương pháp sử dụng buồng (tank method): áp gel điện di lên trên màng nitrocellulose rồi cho chúng vào giữa hai tờ giấy thấm dày và vào giữa lớp nylon bọt mềm. Kẹp tất cả vào giữa hai khung lưới (cassette) rồi đặt vào buồng thấm có sẵn dung dịch đệm sao cho màng nitrocellulose thì ở gần lưới điện cực [+], còn gel điện di thì ở gần lưới điện cực [-].
Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose
Khi áp điện thế vào giữa hai điện cực, các band protein trên gel điện di sẽ chịu tác động của lực điện trường để di chuyển về cực [+], nhờ vậy được chuyển rồi thấm lên màng nitrocellulose.
Sau khi blotting, các band điện di đã được chuyển lên màng nitrocellulose và phát hiện theo nguyên tắc miễn dịch. Tiến trình này gồm các bước:
Trước hết, ủ màng với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp) cho protein muốn tìm, sau đó rửa sạch kháng thể thừa.
Phát hiện protein-kháng thể đặc hiệu bằng cộng hợp là kháng thể thứ cấp (secondary antibodies) gắn đặc hiệu với kháng thể sơ cấp. Cộng hợp này được gắn enzyme peroxidase (Horse radish peroxidase–HRPO) hay alkaline phosphatase (AP). Thông thường là alkaline phosphatase. Cơ chất sinh màu dùng cho cộng hợp alkaline phosphatase là hệ thống BCIP/NBT phát triển bởi Harlow và Lane (1998). Cơ chất cho cộng hợp peroxidase là hệ thống DAB/CoCl2. + _ Màng nitrocellulose Nylon bọt mềm Giấy thấm dày Gel điện di Tank method
3.3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành
A. Western Blotting chuyển band điện di từ gel lên màng nitrocellulose
o Phƣơng pháp sử dụng buồng (tank method)
1.Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin transfer buffer trong 5 – 15 phút để cân bằng ion.
2.Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassette. 3.Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước cất trong 2 – 3 phút.
4.Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau đó kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette. Tất cả các thao tác này đều phải thực hiện trong một khay chứa Towbin transfer buffer.
5.Dùng một pipette thủy tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các lớp.
6.Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực. Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng nitrocellulose gần lưới điện cực [+]. Các bước làm được trình bày như hình trên.
7.Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band.
8.Nối buồng với bộ cấp năng. Bật điện bộ cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V. 9.Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện.
10. Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống.
11. Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào qui trình phát hiện bằng phản ứng miễn dịch.
B. Phát hiện băng protein đặc hiệu bằng phản ứng miễn dịch
12. Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk (blocking buffer) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4oC.
13. Đổ bỏ dịch này, rửa 3 lần trong 10 phút với TTBS. Tiếp tục ủ màng với TTBS có pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o
C.
14. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS
15. Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nồng độ 1/50 000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37o C.
16. Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS. Sau bước này, tiến hành quá trình sinh màu.
17. Cho màng vào dung dịch hiện màu (Pha dung dịch hiện màu bằng cách cho 1 mg DAB vào 4 ml PBS, trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120 µl dung dịch CoCl2 1% vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3µl H2O2 vào dịch mới pha. ). Ủ trong tối trong 5 – 30 phút cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ.
18. Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì để khô rồi gói trong giấy bạc.
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phương pháp SDS–PAGE và Western Blot Mẫu được phân đoạn bằng điện di trên gel
polyacrylamide 12,5%. (gồm 2 gel)
Nhuộm với thuốc nhuộm
Coomassie Blue. Chuyển thẩm qua màng nitrocellulose.
Rửa lần 1 bằng dung dịch giải nhuộm I (Destaining solution I.)
Rửa lần 2 bằng dung dịch giải nhuộm II (Destaining solution II )
Chụp hình
Blocking bằng TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk. Ủ kháng nguyên mục tiêu trên
màng với kháng thể sơ cấp Rửa Ủ với kháng thể thứ cấp có gắn enzyme peroxidase. Rửa Hiện màu Chụp hình
3.3.3. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV đƣợc nhân lên trong tế bào Sf9. (Penaeus vannamei) bằng RTV đƣợc nhân lên trong tế bào Sf9.
A. Nuôi tôm trong phòng thí nghiệm
Môi trường nuôi tôm: * Nhiệt độ: 28 – 300C * pH: 7,8 – 8,5
* Độ mặn: 15 – 20‰ * Sục khí liên tục
Cho tôm ăn:
* Cá hấp xay nhỏ và lòng đỏ trứng gà * Ngày 3 buổi: 8h, 13h và 18h
* Lượng thức ăn bằng 10% trọng lượng cơ thể tôm/ngày
Vệ sinh bể:
* Vào buổi sáng và chiểu tối * Hút loại bỏ chất cặn lơ lửng
B. Thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm
Tôm trước khi thí nghiệm được chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị bệnh âm tính (phần 4.4.1và 4.4.2).
Ghi nhận số tôm sống hàng ngày sau khi gây nhiễm. Tôm chết trong nghiệm thức gây nhiễm được kiểm tra lại bằng phương pháp Dot Blot cho chỉ thị dương tính (phần 4.4.3 và 4.4.4).
Thí nghiệm 1: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm thẻ.
Tôm 35 – 40 ngày tuổi ở Hồ Cốc – Vũng Tàu. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 7 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 8 con:
* Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng - không gây nhiễm.
* Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pmon từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.
* Nghiệm thức 3 (NT3): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pvan từ tôm TCT (RTV-
PvanM): 50 l virus + cá hấp. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày. Sau 1 tuần gây nhiễm thêm 1 lần nữa.
Thí nghiệm 2: Gây nhiễm thực nghiệm đối với tôm sú giống.
Tôm giống 12 ngày tuổi mua ở Cần Giuộc – Long An. Chọn tôm khoẻ và đồng đều. Nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 10 ngày. Thí nghiệm được chia làm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 70 con:
* Nghiệm thức 1 (NT1): Đối chứng – không gây nhiễm.
* Nghiệm thức 2 (NT2): Sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pm từ tôm sú (RTVPmoLA): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng, để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày.
* Nghiệm thức 3 (NT3): sử dụng dịch tế bào nhiễm RTV-Pv từ tôm TCT (RTV-
PvanM): 50 l virus +100 mg lòng đỏ trứng để khô ở -20oC. Cho tôm ăn hết trong vòng 1 ngày.
3.3.4 Phƣơng pháp Dot Blot 3.3.4.1 Nguyên tắc
Protein được đưa trực tiếp lên giấy lọc. Sau đó ủ với kháng thể sơ cấp, đến kháng thể thứ cấp và cho cơ chất tạo màu vào. Cuối cùng là so màu để đánh giá mức độ nhiễm bệnh.
3.3.4.2 Phƣơng pháp tiến hành:
a) Sử dụng 20 µl dịch tế bào nhiễm virus hoặc dịch nghiền đồng thể (đã được ly tâm hoặc lọc qua giấy lọc) từ mẫu tôm nghi nhiễm bệnh đưa lên màng. Để yên khoảng 10 phút cho màng thấm khô.