Nguồn nước biển sử dụng cho nuôi cấy và giữ giống được lấy ở bãi sau biển Vũng Tàu. Nước biển được lọc qua giấy lọc, sau đó cho 200ml vào các bình nước biển thể tích 500ml. bổ sung khoáng và dinh dưỡng và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút.
- Vệ sinh dụng cụ nuôi
ống nghiệm, bình nuôi cấy, bình giữ giống, pipet, đầu típ, xilanh, môi trường (trừ vitamin) đều được hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm trong 20 phút.
3.2.2. Bố trí thí nghiệm
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu.
Thí nghiệm được tiến hành trong bình nước biển 500ml với 4 môi trường nuôi: F/2, Walne, Walne TM, TT3 với 3 lần lặp lại. Tổng cộng số bình thí nghiệm là 12.
Điều kiện thí nghiệm
Ban đầu, quy trình khảo sát được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ ổn định khoảng 280C, chiếu sáng bằng ánh sáng đèn neon). Tuy nhiên, đây là điều kiện áp dụng cho quá trình giữ giống, ức chế quá trình sinh trưởng của tảo. nên trong 2 tuần đầu, mật độ tảo không đủ để thực hiện quá trình nhân giống phục
vụ thí nghiệm.Buộc phải chuyển toàn bộ thí nghiệm ra điều kiện tư nhiên. - Độ mặn: 10%
- Mật độ ban đầu: 230.000 tb/ml
- Cường độ sáng: khoảng 10.000 – 60.000 lux (có lưới che nắng). Chiếu sáng tự nhiên bằng ánh sáng mặt trời.
- Chu kỳ chiếu sáng: tự nhiên
- Nhiệt độ: ngoài trời, biên độ giao động nhiệt độ từ 280
C – 350C, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm khoảng 70
C – 100C.
Mục đích: chọn được môi trường phù hợp cho tăng sinh của tảo Tetraselmis phục vụ cho công tác nghiên cứu và nuôi trồng đại trà.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nhân giống: giống ban đầu được cung cấp bởi phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học (khoảng 10ml) được chuyển toàn bộ vào 100ml môi trường F/2 đã hấp khử trùng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên trong 5 ngày, mật độ đạt được khoảng 230.000 tb/ml.
Chuyển 20ml dịch nuôi vào 180ml môi trường F/2, tiếp tục nuôi trong 5 ngày. Sau đó, chuyển toàn bộ 200ml dịch nuôi này vào bình chứa 800ml môi trường F/2. như vậy, lượng giống sau 15 ngày nuôi cấy đã đủ cho công tác lưu giữ giống và tiến hành thí nghiệm.
- Làm thuần:
Từ bình giống 1L, hút ra 200 ml chia đều cho 4 bình có chứa 50ml các môi trường: F/2, TT3, Walne, Walne TM. Tiến hành nuôi trong thời gian 7 ngày, như vậy, ta có 4 bình môi trường khác nhau (mỗi bình 100ml) để tiến hành thí nghiệm khảo sát môi trường tối ưu.
Mục đích của giai đoạn làm thuần này là giúp tảo thích nghi với điều kiện môi trường mới, tránh stress do thay đổi môi trường đột ngột.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi
Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm, mỗi lô là một môi trường khác nhau gồm 3 bình, mỗi bình 200ml.
Chuyển 20ml dịch nuôi đã làm thuần vào các môi trường tương ứng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên
- Chỉ tiêu theo dõi:
Mật độ tế bào, được theo dõi thông qua chỉ số độ hấp thu ánh sáng (OD) của dịch nuôi. Ghi nhận 2 ngày môt lần.
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Môi trường F/2
Môi trường TT3
Môi trường Walne
Môi trường Walne TM Lưu giữ giống gốc Nhân giống cấp I Làm thuần 20ml
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Định tính lipid trong tảo
Thí nghiệm này được thực hiện tại viện sinh học nhiệt đới tp. HCM Tiến hành thí nghiệm:
Sau thí nghiệm 1, ta chọn được môi trường tăng trưởng tối ưu cho tảo
Tetraselmis, lấy mẫu dịch nuôi trong môi trường này để kiểm tra định tính lipid. Lắc đều dịch nuôi cấy, dùng pipet vô trùng hút 1ml vào eppendort 1.5ml
Thao tác trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy vòng chuyển vài giọt dịch nuôi cấy lên lam kính.
Cố định mẫu bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa (chú ý không để quá nóng sẽ làm vỡ hoặc teo tế bào)
Nhuộm bằng thuốc nhuộm Nile blue A Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Hình 3.3. Nhuộm mẫu tảo với Nile Blue A A. Nhuộm Nile Blue B. Sau khi rửa với acid acetic
3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 3.3.1. Xác định mật độ tế bào
- Mẫu tảo được lấy 2 ngày một lần, một lần trong ngày vào lúc 10 giờ sáng
- Mật độ tế bào được xác định bằng hai phương pháp: + Buồng đếm hồng cầu hiệu Hirschmann của Đức Diện tích 1mm2,
độ sâu 0.1mm
+ Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tảo được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Spectrophotometer) CECIL – CE 1011.
Trên cơ sở đo độ hấp thu ánh sáng (OD) của các dung dịch mẫu với mật độ tảo khác nhau, xác lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ tảo (với bước sóng 660 nm). Từ đó có thể xác định nhanh mật độ của tảo thông qua đo OD.
3.3.2. Xác định độ mặn.
Độ mặn của nước biển được xác định bằng tỷ trong kế của Trung Quốc trước khi bố trí thí nghiệm nhằm xác định và bổ sung NaCl cho đạt theo yêu cầu.
Hình 3.6. Tỷ trọng kế
Hình 3.5.Máy đo OD
A. nhìn ngang B. Nhìn từ trên xuống
3.3.3. Phương pháp định tính Lipid
Định tính lipid bằng phương pháp phổ huỳnh quang nhờ thuốc nhuộm Nile blue.
Công thức phân tử: C20H20C1N30
Hình 3.7. Công thức Nile Blue A
A. Công thức hóa học B. Công thức không gian
Nguyên tắc: Nile blue là thuốc nhuộm huỳnh quang dùng để phân biệt chất béo trung tính từ các acid béo. Thuốc nhuộm này sẽ kết hợp với giọt dầu trong tế bào và phát xạ huỳnh quang màu cam đậm khi được kích thích bằng phổ huỳnh quang màu lục.
Thiết bị phân tích huỳnh quang
Sơ đồ quang học
Hình 3.8.Sơ đồ quang học của máy phân tích huỳnh quang Bộ đơn sắc
Mẫu đo Bộ đơn sắc
Ghi tín hiệu 1 Nguồn sáng 2 3 4 5 Detector A B
Phương pháp nhuộm Nile blue A
- Mẫu tảo được cố định trên lam kính bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn - Nhuộm Nile blue 1%, để 5 phút.
- Rửa nhẹ với dung dịch acid acetic 8% - Rửa lại với nước cất
CHƯƠNG 4:
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu
Tảo Tetraselmis được nuôi tro ng 16 ngày, trên 4 môi trường: F/2, Walne, Walne TM, TT3. Giá trị độ hấp thu mật độ quang (OD) được ghi nhận sau 2 ngày nuôi và 2 ngày một lần, kết quả thu được như sau:
4.1.1. Phương trình đường tuyến tính giữa mật độ và độ hấp thu (OD) của môi trường F/2.