NGUYÊN LIỆU, CHẤT CHUẨN, HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên liệu và chất chuẩn:

Cao Diếp cá được cung cấp bởi công ty TNHH ADC tại Ô Môn, KV Thới Hưng, phường Long Hưng, quận Ô Môn, Thành phố Cần Thơ. Số lô: SE-HCO1-0210.

Quercetin chuẩn do Bộ Y Tế – Viện kiểm nghiệm TP.HCM cung cấp, số lô 104050609, hàm lượng 91,34% C15H10O7, nước 8,51%.

2.1.2. Hóa chất:

Bảng 2.1. Các hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu.

STT Tên nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Acetonitril Merck Phân tích HPLC 2 Acid chlohyric Trung Quốc Tinh khiết PA 3 Acid formic Trung Quốc Tinh khiết PA 4 Acid phosphoric Merck Phân tích HPLC 5 Chloroform Trung Quốc Tinh khiết PA 6 Ethanol 96% Việt Nam TCCS

7 Ethyl acetat Trung Quốc Tinh khiết PA 8 Magnesi Trung Quốc Tinh khiết PA 9 Magnesi carbonate Việt Nam TCCS

10 Methanol Merck Phân tích HPLC 11 Natri hydroxyd Trung Quốc Tinh khiết PA 12 Natri sulfat Trung Quốc Tinh khiết PA

13 Sắt (III) clorid Trung Quốc Tinh khiết PA

12 Talc Mỹ USP 30

2.1.3. Trang thiết bị:

Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu.

STT Tên thiết bị Số hiệu Nguồn gốc

1 Bếp điện JK 071 Nhật

2 Bể siêu âm Elma Đức

3 Cân phân tích Ep 214C-Ohaus Mỹ 4 Máy đo độ rã Pharma test Đức 5 Máy sát hạt và sửa hạt FGS Đức 6 Máy trộn Misuko JBJ103 Nhật

7 Tủ sấy Memmerk Đức

8 Máy soi UV 2 bước sóng ENF-2400C/EF Mỹ 9 Máy HPLC Hitachi L200 Nhật 10 Cân sấy ẩm hồng ngoại MX-50 Mỹ

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC: pháp HPLC:

2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu:

Tiến hành chạy sắc ký trên quercetin chuẩn để tìm các điều kiện sắc ký tối ưu. Chạy sắc ký với mẫu thử ở điều kiện sắc ký thăm dò, tiến hành thay đổi các điều kiện sắc ký để đỉnh chính (tương ứng với quercetin) đạt các thông số sắc ký.

Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân chính xác 25mg chuẩn đối chiếu quercetin cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml methanol, siêu âm trong 10 phút và bổ sung methanol đến vạch, lắc đều để có dung dịch mẹ có nồng độ 500µg/ml.

Từ dung dịch mẹ, tiến hành pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn như sau: lấy chính xác một lượng thể tích dung dịch mẹ cho vào bình định mức, thêm methanol

vừa đủ thu được dung dịch có nồng độ theo yêu cầu. Các số liệu pha mẫu được trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Phương pháp pha các dung dịch có nồng độ thấp hơn.

STT Dung dịch mẹ (ml)

Bình định mức (ml)

Nồng độ dung dịch thu được (µg/ml) 1 1 10 50 2 2 10 100 3 3 10 150 4 4 10 200 5 5 10 250 6 6 10 300

Chuẩn bị mẫu thử: tiến hành theo mục 2.2.1.2.

2.2.1.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá để định lượng quercetin: Diếp cá để định lượng quercetin:

Tiến hành chiết và theo dõi:

- Quá trình chiết quercetin từ dịch thủy phân cao Diếp cá.

- Thời gian để phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn: dịch thủy phân sau mỗi 1 giờ được chiết kiệt Quercetin bằng CHCl3, theo dõi các dịch thủy phân sau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ,...

- Quá trình loại tạp.

Theo dõi bằng thuốc thử FeCl3 trong cồn và sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1). Phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn.

Quy trình chuẩn bị mẫu thử cao Diếp cá:

Cân chính xác khoảng 1 g cao Diếp cá, hòa tan với 10 ml ethanol 25%, lọc, chuyển vào bình lắng gạn, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch

chloroform lắc với với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1).

Dịch A1 cho qua cột SPE tự chế để loại tạp. Cho 20 ml chloroform qua cột SPE để loại tạp phân cực, tiếp theo cho 40ml hỗn hợp CHCl3: EtOAc – 6:4 để lấy phân đoạn chứa quercetin. Cô phân đoạn chứa quercetin đến cắn (A2).

Hòa tan cắn A2 trong methanol rồi cho vào bình định mức 10ml, bổ sung đủ thể tích, lọc sơ bộ. Sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, bỏ vài ml dung dịch đầu trước khi bơm vào hệ thống.

Quy trình chuẩn bị mẫu thử viên nang chứa Cao diếp cá:

Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân lượng bột thuốc tương ứng với 1g cao Diếp cá, hòa tan trong 10 ml cồn 25%, lọc thu lấy dịch lọc, rửa cắn với khoảng 2 ml cồn 25%, thêm vào 20 ml chloroform, lắc đều 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn, rút bỏ dịch chloroform. Dịch nước còn lại hòa tan với 10 ml dung dịch HCl 10%/cồn 25% đun hồi lưu. Dịch thủy phân thu được lắc với 20 ml chloroform trong 5 phút, chuyển vào bình lắng gạn để yên 60 phút, rút lấy dịch chloroform. Lặp lại 3 lần. Gộp dịch chloroform lắc với 20 ml nước. Rút dịch chloroform lọc qua Na2SO4 sau đó đem cô đến dịch CHCl3 đậm đặc (A1).

Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu thử. HCl 10% / cồn 25% Thủy phân 3h Cao Diếp cá (Viên Diếp cá) Dịch cồn 25% Dịch thủy phân Dịch CHCl3 Dịch CHCl3 đậm đặc

Hòa tan vào cồn 25%, lọc

Lắc với CHCl3, gạn bỏ lớp CHCl3 Lắc với H 2O, gạn bỏ lớp nước. Lọc qua Na 2SO 4 Cô đến dịch CHCl3 đậm đặc Lắc với CHCl3 3 lần Dịch SPE chứa Quercetin Cột SPE tự chế Cắn Cô đến cắn

2.1.1.3. Thẩm định quy trình định lượng:Tính tương thích hệ thống: Tính tương thích hệ thống:

Tính tương thích hệ thống của quy trình phân tích được xác định trên giá trị và độ lặp lại của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành thực hiện quy trình trên mẫu chuẩn và mẫu thử với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp.

- Tiến hành:  Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn.

 Chạy sắc ký 6 lần với mẫu chuẩn và mẫu thử.

 Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh.

 Xử lý thống kê các giá trị thu được.

- Yêu cầu:  RSD ≤ 2%.

Thẩm định quy trình:

Tính đặc hiệu

- Tiến hành:  Chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng (là mẫu chỉ gồm tá dược), mẫu dung môi pha mẫu, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2%.

 Tiến hành chạy sắc ký.

- Yêu cầu:  Mẫu trắng, mẫu dung môi, mẫu dung dịch nước acid phosphoric 0,2% không có các pic trùng với đỉnh chính (tương ứng với quercetin).

Tính tuyến tính

- Tiến hành:  Chạy sắc ký và xác định hàm lượng 6 dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau.

 Xây dựng đường chuẩn và xác định R2.

 Thẩm định lại phương trình đường chuẩn bằng phương pháp thống kê.

- Yêu cầu: R2 ≥ 0,99.

- Tiến hành:  Xử lý 6 mẫu thử nồng độ bằng nhau.

 Xác định hàm lượng quercetin trong mỗi mẫu thử.

 Tính hàm lượng trung bình và RSD%.

- Yêu cầu:  RSD nằm trong giới hạn cho phép của AOAC.

Độ đúng

- Tiến hành:  Thêm lượng chất chuẩn quercetin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng quercetin có trong mẫu thử.

 Định lượng tìm lại hàm lượng hàm lượng quercetin đã thêm vào để xác định tỷ lệ phục hồi.

- Yêu cầu:  Tỷ lệ phục hồi trong giới hạn cho phép của AOAC.

2.2.2. Xây dựng công thức viên nang chứa cao Diếp cá:

Quá trình nghiên cứu như sau: thiết kế công thức → tạo hạt → khảo sát đặc tính của hạt → đóng nang → thử độ rã → lựa chọn công thức chế phẩm.

Công thức được thiết kế dựa theo phương pháp cổ điển của Gauss – Geidell. [8]

2.2.2.1. Thiết kế công thức viên nang chứa cao Diếp cá:Lựa chọn hàm lượng cao thích hợp: Lựa chọn hàm lượng cao thích hợp:

Cao dược liệu có khả năng hút ẩm rất lớn, hàm lượng cao càng nhiều thì khả năng hút ẩm càng mạnh. Vì vậy, chọn hàm lượng cao thích hợp sao cho giảm bớt lượng tá dược sử dụng mà vẫn đảm bảo độ ẩm thích hợp cho việc đóng nang là điều cần thiết. Để thực hiện điều này chúng tôi tiến hành như sau:

- Thiết kế các công thức với hàm lượng cao khác nhau, giữ nguyên tỷ lệ tá dược hút tối đa có thể sử dụng trong công thức.

- Tiến hành tạo hạt và khảo sát độ ẩm lúc cân bằng để tìm hàm lượng cao thích hợp.

- Hàm lượng cao thích hợp là hàm lượng cao cao nhất và có độ ẩm bột thuốc lúc cân bằng ≤ 5%.

Cao dược liệu có độ dính khá lớn, vì vậy có thể làm ẩm bằng nước và tiến hành sát hạt, tuy nhiên tỷ lệ bột mịn thường cao. Do vậy chúng tôi chọn PVP K30 làm tá dược dính với hàm lượng là 2%.

Lựa chọn hàm lượng tá dược hút:

Xây dựng công thức với hàm lượng tá dược hút lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, xác định độ ẩm lúc cân bằng của khối bột thuốc.

Chọn hàm lượng tá dược hút sao cho độ ẩm lúc cân bằng < 5%.

Lựa chọn tá còn lại và tối ưu công thức viên nang:

Sau khi chọn hàm lượng cao và các loại tá dược, chúng tôi tiến hành thiết kế 10 công thức với 2 loại tá dược độn A và B có tỷ lệ: 3:1, 2:1, 1:1, 1:2,1:3; tỷ lệ tá dược hút ở giá trị tối đa và tối thiểu, cố định tá dược dính và cao.

Bảng 2.4. Các công thức thiết kế tối ưu công thức viên nang.

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Cao Diếp cá A% A% A% A% A% A% A% A% A% A%

MgCO3 X1% X1% X1% X1% X1% X2% X2% X2% X2% X2%

Tá dược

độn A Y1% Y2% Y3% Y4% Y5% Y1% Y2% Y3% Y4% Y5% Tá dược

độn B Y5% Y4% Y3% Y2% Y1% Y5% Y4% Y3% Y2% Y1% PVP K30 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2%

Talc 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1%

Tiến hành khảo sát các đặc tính của khối bột thuốc: góc chảy, sự phân bố cỡ hạt, độ ẩm; đo độ rã của viên nang thành phẩm và chọn công thức tối ưu.

2.2.2.2. Phương pháp khảo sát đặc tính của khối bột thuốc và đo độ rã của viên nang: viên nang:

Đo độ ẩm của khối bột thuốc: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại với các thông số như sau

- Lượng cân: khoảng 3g. - Nhiệt độ sấy: 105oC.

- Tốc độ độ ẩm tới hạn: 0,01%/phút.

Khảo sát sự phân bố cỡ hạt:

Cân 50g bột thuốc, cho qua bộ rây gồm các rây 0,45mm; 0,3mm; 0,2mm, lắc đều 5 phút, cân lượng bột còn lại trên mỗi rây, vẽ đường phân bố cỡ hạt.

Xác định tỷ trọng biểu kiến trước và sau khi gõ:

Xác định tỷ trọng biểu kiến trước khi gõ (tỷ trọng thô) và tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ (tỷ trọng vỗ) theo công thức sau:

Với:

ρ: Tỷ trọng biểu kiến của hạt.

M: Khối lượng của hạt. Vb: Thể tích biểu kiến của hạt.

Tỷ trọng biểu kiến sau khi gõ xác định theo USP30 trên máy đo tỷ trọng biểu kiến Pharma test touch.

Xác định lưu tính của hạt: đo góc chảy

Cân 50g bột thuốc, đổ hạt chảy liên tục để tạo thành khối chóp và xác định góc nghỉ α biết:

Trong đó:

h: chiều cao khối bột.

r: bán kính đáy của khối bột.

b V M = ρ r h tgα=

Hình 2.1. Phương pháp xác định góc nghỉ của bột, hạt thuốc.

Độ tan rã:

Thực hiện theo DĐVN IV, phụ lục 11.4.

2.2.2.3. Quy trình điều chế viên nang chứa cao diếp cá:

- Trộn đều cao Diếp cá với magnesi carbonat, tá dược độn A và B bằng tay sau đó bằng máy trộn, sấy khối bột ở 50oC trong 12 giờ.

- Pha tá dược dính: pha PVP K30 nồng độ 7,5% trong cồn 50%.

- Trộn đều khối bột thuốc với tá dược dính, sát hạt qua rây 1,2mm, tốc độ vòng 70 vòng/phút, sau đó sấy trong tủ sấy 12 giờ ở 50oC.

- Sửa hạt qua rây 0,6mm, tốc độ vòng 50 vòng/phút, thêm bột talc, trộn hành tinh 5 phút.

- Đóng nang số 0 bằng máy đóng nang thủ công (the capsule machine).

2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nang chứa cao Diếp cá:2.2.3.1. Hình thức cảm quan:quan sát bằng mắt thường. 2.2.3.1. Hình thức cảm quan:quan sát bằng mắt thường.

2.2.3.2. Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.3.2.2.3.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6. 2.2.3.3. Độ tan rã: thử theo DĐVN IV, phụ lục 11.6.

2.2.3.4. Độ ẩm: đo độ ẩm bằng cân sấy ẩm hồng ngoại giống mục 2.2.2.2.2.2.3.5. Định tính: 2.2.3.5. Định tính:

Bằng phản ứng hóa học:

Cho bột thuốc trong nang vào cối chày và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,5g cao Diếp cá hòa tan trong khoảng 15ml cồn 96%, đun nóng nhẹ. Lọc lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm làm các phản ứng.

Bảng 2.5. Định tính viên nang chứa cao Diếp cá bằng phản ứng hóa học. 2r

h

Thuốc thử Cách tiến hành Yêu cầu

NaOH 1% Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt NaOH 1%.

Dung dịch chuyển sang màu vàng sáng.

FeCl3 1% Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt FeCl3 1%.

Dung dịch chuyển sang màu xanh đen.

Mg + HCl đậm đặc

Cho dịch chiết vào ống nghiệm lớn đã chứa sẵn một ít bột Mg kim loại. Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 – 2 ml HCl đậm đặc.

Xuất hiện màu đỏ.

Bằng sắc ký lớp mỏng:

Mẫu chuẩn: cho một ít tinh thể quercetin vào ống nghiệm, thêm vài giọt methanol để hòa tan.

Mẫu thử: cân một lượng bột thuốc đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,5g cao Diếp cá, hòa tan trong 5ml cồn 96%, lọc thu lấy dịch lọc. Thêm vào 5ml dung dịch HCl 10% rồi đun cách thủy để thủy phân. Lắc dịch đã thủy phân với 10ml chloroform, lấy dịch thủy phân chấm sắc ký.

Bản mỏng: silicagel F254 (Merck).

Hệ dung môi: Chloroform – Ethyl acetat – Acid formic (5:4:1).

Phát hiện: bằng đèn UV ở bước sóng 254nm, nhúng thuốc thử FeCl3 trong cồn.

2.2.3.6. Định lượng:

Định lượng bằng phương pháp HPLC.

Các điều kiện HPLC thực hiện theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát, dung dịch chuẩn và thử thực hiện theo mục 2.2.1.2.

Hàm lượng quercetin trong một nang:

Trong đó: St: diện tích đỉnh mẫu thử. m S a P C S viên g X c c t × × × × × = 10 ) / (µ

Sc: diện tích đỉnh mẫu chuẩn.

Cc: nồng độ chất chuẩn trong dung dịch (µg/ml). m: khối lượng bột thuốc đã cân (gam).

P: khối lượng trung bình của viên (gam). a: Hàm lượng cao trong viên nang.

Yêu cầu: hàm lượng quercetin nằm trong giới hạn 218,25 µg đến 266,76 µg tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang.

3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC: QUERCETIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC:

3.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký tối ưu:

Hình 3.1. Sắc ký đồ 3D mẫu thử ở bước sóng từ 250nm – 450nm.

Nhận xét: ở bước sóng 370nm, quercetin có đỉnh cực đại hấp thu ít bị ảnh hưởng bởi các tạp khác có trong mẫu thử.

Qua thực nghiệm chúng tôi đề xuất các điều kiện sắc ký tối ưu như sau: - Cột: LiChrospher RP-18 (250 x 4mm, 5µm).

- Dung môi pha động: MeOH - dịch ước acid phosphoric 0,2% (60:40). - Bước sóng phát hiện: 370nm.

- Tốc độ dòng: 0,8ml/phút. - Nhiệt độ: 25oC.

3.1.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu cao Diếp cá và viên nang chứa cao Diếp cá:

UV 254 Thuốc thử FeCl3

Hình 3.3. Sắc ký đồ các dịch thủy phân quercetin sau 1h, 2h và 3h.