Giải trình tự vùng D-loop

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop

Nguyên tắc chung:

Trình tự vùng D-loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp do Sanger và đtg phát minh vào năm 1977: tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang (fluochrome). Mỗi loại ddNTP đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamid, kết quả sẽ đƣợc xử lí qua một hệ thống vi tính [1], [13], [56].

Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng nhân bản DNA để đọc trình tự bao gồm: mồi

L16725: 3,2 pmol, 200 ng DNA khuôn (sản phẩm PCR đã tinh sạch), BigDye 0,5X, đệm 1X và H2O với tổng thể tích 15 l.

Chu trình nhiệt:

Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại DNA trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 nhƣ sau: 96^oC - 4 phút; 25 chu kỳ (96^oC - 10 giây, 50^oC - 5 giây, 60^oC - 4 phút). Sản phẩm đƣợc giữ ở 4^oC.

Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/ EDTA:

- Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 l EDTA 125 mM (pH = 8); 60 l EtOH 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở -20oC, 3 giờ. Sau đó ly tâm 12000 rpm, 15 phút để tủa DNA trong đó.

- Loại bỏ EtOH và rửa tủa bằng 60 l EtOH 70%. Ly tâm 12000 rpm

trong 10 phút.

- Làm khô tủa và bổ sung 10 l Hi-Di TM

Formamide để làm tan tủa và biến tính ở 95o

C trong 5 phút.

Sau bƣớc này các mẫu đƣợc đƣa vào các giếng của khay đựng mẫu sau đó điện di trong ống mao quản 80 cm x 50 m chứa POP-4™ của hãng ABI,

Mỹ. Vùng điều khiển D-loop đƣợc xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM^ 3100 Genetic Analyzer.