IV. KẾT QUẢ THỰC HIỆN 1 Kết quả khoa học cụng nghệ.
1.1 Hoàn thiện qui trỡnh sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng trờn thiết bị lờn men chỡm qui mụ cụng nghiệp.
thiết bị lờn men chỡm qui mụ cụng nghiệp.
1.1.1.Tuyển chọn, xỏc định bộ giống vi sinh vật đa hoạt tớnh
Từ bộ giống VSV thuộc đề tài KC04-04 và Quỹ gen vi sinh vật nụng nghiệp, dự ỏn đó tiến hành tuyển chọn và đỏnh giỏ hoạt tớnh sinh học của một số chủng vi sinh vật. Trờn cơ sở lý lịch khoa học về hoạt tớnh sinh học của một số chủng vi sinh vật đó biết về hoạt tớnh cốđịnh nitơ, phõn giải photphat khú tan, sinh tổng hợp chất kớch thớch sinh trưởng thực vật và đối khỏng vi khuẩn, nấm gõy bệnh vựng rễ, kết quả cụ thể như sau:
a).Azotobacter
10
liệu sản xuất phõn bún vi sinh vật đa chủng, chức năng. Kết quả nghiờn cứu đỏnh giỏ khả năng đa hoạt tớnh của Azotobacter được tổng hợp trong bảng 1 cho thấy ngoài khả năng cốđịnh nitơ cả 3 chủng Azotobacterđều cú khả năng sinh tổng hợp IAA và polysacharit. Chủng Azotobacter 106 cú khả năng đối khỏng vi khuẩn gõy bệnh hộo xanh trờn cả lạc, khoai tõy và cà chua. Kết quả đỏnh giỏ khả năng phõn giải lõn và đối khỏng VSV gõy bệnh vựng rễ cõy trồng cạn cho thấy cỏc chủng Azotobacter cú biểu hiện, song mức độ khụng cao.
Bảng 1. Hoạt tớnh sinh học của cỏc chủng Azotobacter.
Chủng Azotobacte.
TT Hoạt tớnh sinh học 70 106 108
1 Cố định nitơ (àmol Etylen/ml/ngày)
4345,6 3207,2 4281,6
2 Hàm lượng IAA thụ sau 5 ngày nuụi cấy (àg/ml)
430 32 39
3 Vũng ức chế vi khuẩn hộo xanh lạc (D-d cm)
0,6 0,3 1,6
4 Vũng ức chế vi khuẩn hộo xanh
cà chua (D-d cm) - 1,6 1,6
5 Vũng ức chế vi khuẩn hộo xanh
khoai tõy ( chế D-d cm) - 1,4 -
6 Lượng polyshacarit (g khụ/l) 360 489 353
b). Rhizobium
Rhizobium là vi khuẩn sống cộng sinh với cõy họ đậu, cú khả năng cố định nitơ và cung cấp nitơ cho cõy chủ. Kết quả nghiờn cứu khả năng hỡnh thành nốt sần và cố định nitơ của cỏc chủng Rhizobium đó xỏc định cả 3 chủng sử dụng trong nghiờn cứu đều cú khả năng hỡnh thành nốt sần và cố định nitơ, trong đú chủng RA 42.2 cú hoạt tớnh mạnh hơn cả (bảng 2). Kết quả nghiờn cứu cũng cho thấy 2 chủng RA 42.2 và RA 18 cú khả năng chịu được nồng độ khỏng sinh ở mức 30 ppm. Hai chủng này sẽ cú khả năng cạnh tranh cao với quần thể vi sinh vật vựng rễ cõy trồng. Kết quả đỏnh giỏ hoạt tớnh sinh tổng hợp hoạt chất kớch thớch sinh trưởng thực vật (IAA), phõn giải lõn và đối khỏng VSV gõy bệnh vựng rễ cõy trồng cạn cho thấy cỏc chủng Rhizobium khụng thể hiện rừ nột.
11
Bảng 2. Hoạt tớnh sinh học của cỏc chủng Rhizobium
Chủng Rhizobium
TT Hoạt tớnh sinh học RA04 RA18 RA442
1 Cố định nitơ (nmol C2H4/cõy/ngày) 4345,6 3207,2 4281,6 2 Nốt sần hữu hiệu (nốt sần/cõy) 13 11 115 3 Khả năng chịu Streptomycin ở nồng độ 30 ppm - - - 4 Khả năng chịu Spectinomycin ở nồng độ 30 ppm - + + 5 Khả năng chịu Tetracilin ở nồng độ 30 ppm - - - c). Bacillus
Bảng 3. Hoạt tớnh sinh học của cỏc chủng Bacillus
Chủng vi khuẩn Đường kớnh vũng phõn giải lõn (mm) sau 5 ngàynuụi cấy Hàm lượng lõn tan (àg/l) sau 5 ngày nuụi cấy Hàm lượng IAA (àg/ml) sau 4 ngày nuụi cấy Đường kớnh (D- d) ức chế VKHX lạc (mm) B04 11,5 6 87 8,0 B08 14,6 5 186 4,0 B10 14,5 6 87 15,0 B14 21,5 20 352 11,0 B16 11,5 6 133 15,7 B17 4,0 1 238 1,4 B18 14,6 15 263 18,0 B24 15,5 6 82 5,0 B34 11,5 1 90 10,0
Kết quả nghiờn cứu về cỏc hoạt tớnh sinh học của 9 chủng Bacillus được tổng hợp trong bảng 3 cho thấy cả 9 chủng vi sinh vật đều cú khả năng chuyển hoỏ Ca3PO4 thành dạng hoà tan. Thời gian hỡnh thành vũng phõn giải từ 1 đến 3 ngày nuụi cấy. Trong số cỏc chủng Bacillus nghiờn cứu chủng B14 cú hoạt tớnh phõn giải photphat vụ cơ cao hơn cả, đồng thời chủng vi khuẩn này cũng cú khả năng sinh tổng hợp photphataza cú khả năng khoỏng hoỏ lõn hữu cơ. Hầu hết cỏc Bacillus
12
nghiờn cứu đều cú khả năng sinh tổng hợp IAA và đối khỏng vi khuẩn gõy bệnh hộo xanh trờn lạc, cà chua và dưa hấu.
d). Cỏc vi sinh vật khỏc đối khỏng nấm gõy bệnh vựng rễ cõy cụng nghiệp
Từ 15 chủng vi sinh vật cú khả năng đối khỏng nấm bệnh dự ỏn đó tiến hành đỏnh giỏ khả năng ức chế cả nấm và vi khuẩn gõy bệnh chết hộo trờn cõy cụng nghiệp và xỏc định được 4 chủng cú khả năng đối khỏng với cả 2 đối tượng gõy bệnh,. Kết quảđược tập hợp tại bảng 4.
Bảng 4. Khả năng ức chế F. oxysporum và R. solanacearum
của một số vi sinh vật đối khỏng
Đường kớnh vũng đối khỏng (mm) Kớ hiệu chủng R. solanacearum F. oxysporum TH10 12 21 DC29 18 22 CC5.10 15 18 VCM 1158 14 19
1.1.2 Định tờn và xỏc định độ an toàn sinh học của cỏc vi sinh vật đa hoạt tớnh.
Trờn cơ sở kết quả đỏnh giỏ hoạt tớnh sinh học cỏc chủng vi sinh vật
được lựa chọn và kết hợp với kết quả nghiờn cứu của đề tài cấp Nhà nước
“Nghiờn cứu cụng nghệ sản xuất phõn bún VSV đa chủng, phõn bún chức năng phục vụ chăm súc cõy trồng cho một số vựng sinh thỏi” mó số KC 04.04, dự ỏn đó tiến hành xỏc định tờn cỏc chủng vi sinh vật chưa được xỏc định tờn bằng kỹ thuật 16S ARN riboxom và đỏnh giỏ mức độ an toàn sinh học theo hướng dẫn số 90/679/EWG của cộng đồng Chõu Âu về an toàn sinh học, nhúm tỏc nhõn sinh học “Vi khuẩn”. Từ kết quảđỏnh giỏ độ an toàn, dự ỏn đó xỏc định 10 chủng vi sinh vật kớ hiệu 70,108, RA18, Ra42.2. B10, B18, B17, B16, DC29, B04 được xếp loại mức độ an toàn cấp 1 và cấp 2 cú thể ứng dụng sản xuất trong điều kiện bỡnh thường. Chủng TH10 cú hoạt tớnh sinh học cao, tuy nhiờn do mức độ an toàn sinh học được xếp ở cấp độ 3 (nhúm vi sinh vật hạn chế sử dụng), do vậy dự ỏn khụng sử dụng cho sản xuất phõn bún VSV đa chủng, chức năng.
1.1.3 Nghiờn cứu khả năng tổ hợp cỏc chủng vi sinh vật đa hoạt tớnh
Trờn cơ sở tớnh sinh học, nguồn gốc phõn lập và ảnh hưởng đối với cõy trồng đó được đỏnh giỏ trong khuụn khổ đề tài KC.04.04, dự ỏn đó xỏc định cỏc tổ hợp vi sinh vật sử dụng cho sản xuất phõn bún vi sinh vật chức năng đối với cỏc loại cõy trồng khỏc nhau (bảng 5).
13
Bảng 5. Tổ hợp vi sinh vật sử dụng cho cỏc loại cõy trồng. Đối tượng cõy
trồng sử dụng Tờn vi sinh vật Ký hiệu Hoạt tớnh sinh học chớnh
Azotobacter beijerinckii 108 CĐNT Bacillus subtilis B10 PGL Bacillus polyfermenticus B16 ĐK VKHX Cõy nụng nghiệp ngắn ngày Bacillus subtilis B18 PGL
Bradyrhizobium japonicum RA18, RA42.2 CĐNT
Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Cõy họđậu Bacillus subtilis B18 PGL Azotobacter beijerinckii 70 CĐNT Bacillus subtilis B14 PGL Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Hồ tiờu Bacillus polyfermenticus B10 PGL Azotobacter beijerinckii 108 CĐNT Bacillus subtilis B18 PGL Pseudomonas chlororaphis DC29 ĐK nấm bệnh Cà phờ và cõy cụng nghiệp dài ngày khỏc Bacillus subtilis B14 PGL
CĐNT: Cốđịnh nitơ, PGL: phõn giải lõn; ĐKVKHX: Đối khỏng vi khuẩn hộo xanh
Kết quảđỏnh giỏ giỏ mật độ, hoạt tớnh sinh học theo thời gian bảo quản của cỏc vi sinh vật đa hoạt tớnh trong cỏc tổ hợp cho thấy, mật độ và hoạt tớnh sinh học của cỏc chủng vi sinh vật lựa chọn trong điều kiện hỗn hợp và riờng lẻ khụng cú sự sai khỏc đỏng kể trong thời gian bảo quản 6 thỏng. Như vậy cú thể sử dụng hỗn hợp cỏc vi sinh vật đa hoạt tớnh trong sản xuất phõn bún vi sinh vật chức năng sử dụng cho cỏc loại cõy trồng.
1.1.4. Qui trỡnh sản xuất chế phẩm vi sinh vật chức năng
Trờn cơ sở cỏc nghiờn cứu về mụi trường nhõn sinh khối cỏc chủng vi sinh vật lựa chọn thuộc cỏc giống Azotobacter, Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas và cỏc
14
điều kiện sinh trưởng phỏt triển tối ưu trong điều kiện lờn men chỡm, dự ỏn đó tổng hợp được cỏc thụng số kỹ thuật trong nuụi cấy nhõn sinh khối cỏc vi sinh vật trờn thiết bị lờn men chỡm. Kết quả được tập hợp tại bảng 6. Kết quả nghiờn cứu của dự ỏn đó mở ra hướng sử dụng cỏc nguyờn liệu sẵn cú rẻ tiền ở Việt Nam thay thế cho cỏc hoỏ chất chuyờn dụng, giỏ thành cao. Sinh khối cỏc vi sinh vật lờn men trờn thiết bị lờn men chỡm cú mật độ đạt 108-109 CFU/ml sau thời gian lờn men 35-48 giờ đối với Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter. Riờng chủng Rhizobium thời gian nhõn sinh khối là 120 giờ.
Bảng 6. Điều kiện lờn men tối ưu của cỏc vi sinh vật đa hoạt tớnh trờn thiết bị lờn men chỡm quy mụ cụng nghiệp.
Chủng vi sinh vật Thụng số kỹ thật
Bacillus Rhizobium Pseudomonas Azotobacter
Ph 6,5-7,0 6,8 7,0 6,8-7,0
Nhiệt độ lờn men (oC) 30±2 30±1 30 28-32 Thời gian lờn men (giờ) 36h 120h 35h 48h Tỷ lệ giống gốc (%) 5% 5% 5% 5%
Mụi trường lờn men SX2 SX7 CT4 SX4
0 giờ - 6 giờ 220 220 220 220 6 giờ - 12 giờ 300 300 300 300 Tốc độ cỏnh khuấy (vũng/phỳt) 12h giờ - kết thỳc 350 350 350 350 Lưu lượng cấp khớ (dm3 khớ/dm3 mụi trường/phỳt) 0,75 0,64 0,75 0,75 Dịch vi sinh vật sau nhõn sinh khối trờn thiết bị lờn men chỡm được đưa vào mỏy ly tõm liờn tục (separator) để tỏch nước tự do. Vận tốc ly tõm ban đầu là 15000 vũng/ phỳt sau đú tăng từ từđể đạt vận tốc 20000 vũng/phỳt. Mật độ tế bào vi sinh vật sau ly tõm được xỏc định thụng qua phương phỏp nuụi cấy pha loóng. Kết quả cho thấy mật độ vi sinh vật trong sinh khối vi sinh vật đó tăng 10 đến 100 lần. Kết quả nghiờn cứu này đó mở ra triển vọng tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng chức năng đậm đặc với mật độ vi sinh vật hữu ớch cao hơn hẳn chế phẩm truyền thống sản xuất trờn cơ sở phối trộn sinh khối vi sinh vật sau lờn men với chất mang đó xử lý.
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu hoàn thiện ở trờn kết hợp với cỏc kết quả nghiờn cứu trong khuụn khổ đề tài KC04.04 về chất mang cho sản xuất phõn vi sinh vật đa chủng chức năng (VSVĐCCN), dự ỏn đó tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm được tập hợp trong bảng 7 đó xỏc định chế phẩm cú chất lượng cao hơn yờu cầu về chế phẩm phõn bún vi sinh vật được qui định trong TCVN.
Với qui trỡnh đó hoàn thiện, dự ỏn tổ chức sản xuất chế VSVĐCCN đậm đặc và phối hợp với 3 cụng ty sản xuất phõn bún hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng
15
(HCVSVĐCCN) với số lượng khoảng 8000 tấn, trong đú chế phẩm được sử dụng với liều lượng 1kg/1tấn nguyờn liệu hữu cơ. Sản phẩm phõn HCVSVĐCCN được sử dụng tại nhiều địa phương trong cả nước và được người nụng dõn đỏnh giỏ cao. Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của phõn HCVSVĐCCN sản xuất trờn nền hữu cơ đó xử lý và chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng đậm đặc được trỡnh bày chi tiết trong mục 1.2.3. Kết quả đỏnh giỏ hiệu quả phõn hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng đối với cõy trồng.
Bảng 7. Mật độ cỏc nhúm vi sinh vật chớnh chứa trong chế phẩm vi sinh vật chức năng đậm đặc
Nhúm vi sinh vật Đơn vị đo Mật độ