B. Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các mediator
Các chất ức chế của laccase thƣờng là các ion nhỏ nhƣ azide, cyanide, fluoride. Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên và cản trở các dòng điện tử đi đến các nguyên tử này. Các chất ức chế laccase khác là ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), acid béo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhƣng chúng chỉ có tác dụng ức chế ở nồng độ cao hơn. Các hợp chất chứa sulfhydryl nhƣ L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acid cũng đƣợc coi là các chất ức chế laccase.
6.4 Tính chất hóa sinh của laccase
Hoạt tính xúc tác của enzyme đƣợc đặc trƣng bởi hằng số Michaelis - Menten (Km). Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2 – 500µM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử 2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide). Ái lực đối với oxy thì ít phụ thuộc vào enzyme hơn và chỉ dao động trong khoảng 20 - 50µM.
A
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic. Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm, nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase. Mặt khác, tăng pH còn làm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxy hóa bởi laccase hơn. Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của hai tác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tác dụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide. Đối với các cơ chất không phải phenolic nhƣ ABTS thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3. Ngƣợc lại, tính bền của laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9.
Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote ví dụ, thời gian bán hủy của laccase của
Streptomyces lavendulae là 100 phút ở 70oC và của protein cotA từ loài
Bacillus subtilis là 112 phút ở 80oC. Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc nấm thƣờng là nhỏ hơn 1 giờ ở 70oC và dƣới 10 phút ở 80o
C [9,35,43,55].
6.5 Sự phân bố và một số vi sinh vật sinh laccase
Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, chúng đƣợc tìm thấy ở thực vật, nấm, một số vi khuẩn và côn trùng. Laccase lần đầu tiên đƣợc phát hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera. Việc nghiên cứu laccase trên đối tƣợng thực vật và nấm đảm rất phổ biến. Laccase từ nấm đƣợc nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ nấm đảm Basidomyces. Ngoài ra các các loài
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
35
năng phân hủy ligincellulose nhƣ Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotus ostrotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor [35]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này trên các đối tƣợng nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn lại không nhiều. Một số vi sinh vật có khả năng sinh laccase đƣợc miêu tả ở phụ lục 3 [21,25,38,44,56,60].
6.6 Gene mã hóa laccase
Trong vài thập kỷ gần đây, gene sinh tổng hợp laccase đã bắt đầu đƣợc nghiên cứu. Cho đến nay đã có hơn 100 gene sinh tổng hợp laccase đƣợc đánh giá và so sánh. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên đối tƣợng vi sinh vật. Năm 1998 gene laccase đầu tiên đƣợc phân lập và giải trình tự từ nấm đảm
Neurospora crassa và nấm sợi Aspergillus nidulans. Tuy nhiên các gene
tƣơng ứng với các protein laccase hoàn chỉnh mới chỉ có khoảng 20 gene, phần lớn trong số đó là từ nấm đảm [9,32,35,44,60] ( Phụ lục 4).
Đối với nấm đảm và thực vật bậc cao, các gene laccase thƣờng có nhiều intron. Số lƣợng intron trong mỗi gene thƣờng từ 8 – 13 đoạn, mỗi đoạn có kích thƣớc khoảng 50 – 90 nucleotit. Ngoài ra cũng có những gene laccase chỉ có một intron nhƣ Neurospora crassai, ngƣợc lại Pleurotus ostreatus lại
có đến 19 đoạn intron. Các gene điển hình mã hóa protein laccase thƣờng có kích thƣớc khoảng 500 – 600 axit amin.
Ở nhiều chủng nấm trong bộ gene chứa nhiều gene mã hóa sinh tổng hợp laccase. Trametes villosa chứa ít nhất 5 gene mã hóa cho laccase, Coprinus cinereus chứa ít nhất 8 gene và Rhizoctonia solani, Pleurotuss sajor-caju chứa ít nhất là 4 gene mã hóa laccase. Tuy nhiên các gene này nằm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36
ở các allen khác nhau trên nhiễm sắc thể và các trình tự bảo thủ liên quan đến vị trí liên kết với các nguyên tử đồng lại đồng thời cũng có mặt trong các gene mã hóa các enzyme oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng khác, chính những điều này đã gây khó khăn trong việc phân lập và xác định chính xác số gene mã hóa cho laccase.
Sự biểu hiện của gene sinh tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng. Với mỗi chủng khác nhau thì đòi hỏi điều kiện môi trƣờng thích hợp cho sinh tổng hợp laccase khác nhau. Nhƣ môi trƣờng giàu nitơ làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase ở chủng Pleurotus sajor-caju,
nhƣng chủng Lentinula edodes lại có khả năng sinh tổng hợp laccase t ốt hơn
trên môi trƣờn g có hàm lƣợng nitơ thấp . Đồng và các ion kim loại khác nhƣ Hg2+, Mg2+, Cd2+ và một số hợp chất vòng thơm đƣợc xem là những nhân tố hoạt hóa mạnh quá trình sinh tổng hợp laccase. Quá trình hoạt hóa gene sinh tổng hợp laccase bởi các ion kim loại hoặc các hợp chất phenol chƣ́ng minh là đƣợc điều khiển bởi một trình tự điều hòa của vùng promoter của gene [32,35].
Gene mã hóa sinh tổng hợp laccase đã đƣợc chuyển vào nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
niger, A. nodulan, A. oryzae, cây thuốc lá v.v. Trong nghiên cứu mới nhất
(2009) Xiaoshu Shao và cộng sự đã chỉ ra rằng, hoạt tính của laccase từ
Shigella dysenteriae đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Wlac) tăng từ
24,4 UI/mg lên 52,9 UI/mg sau khi thay thế hai axit amin Glu 106 bằng Phe 106 trong chuỗi xoắn anpha (WlacS). Với kỹ thuật đột biến xóa đoạn trong chuỗi xoắn anpha t ừ Leu 351 đến Gly 378 (WlacD), hoạt tính enzyme tăng 3,5 lần so với laccaseWlac). Đồng thời cả hai WlacS và WlacD đều bền nhiệt hơn Wlac [60].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
Trình tự gene mã hóa laccase có thể chia thành 3 nhóm chính là
Ascomycete, Basidomycete và thực vật bậc cao. Tuy nhiên các nghiên cứu về
gene mã hóa laccase ở prokaryote hiện nay không nhiều.
6.7 Ứng dụng của laccase
Phƣơng pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme đƣợc xem là phƣơng pháp khả quan có thể thay thế các phƣơng pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với môi trƣờng và đặc biệt là do phản ứng bởi enzyme thƣờng rất đặc hiệu và có hiệu suất cao. Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử đắt tiền khác nhƣ NAD(P)+. Laccase đƣợc sử dụng trong một số ngành nhƣ công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp hóa mỹ phẩm, hóa thực phẩm, dƣợc phẩm v.v. Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor có độ nhạy cao. Ngoài ra còn đƣợc sử dụng trong phân hủy các hợp chất lignincellulose và xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy [11,17,35,52,58].
Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân hủy các chất độc thông qua quá trình oxy hóa đặc biệt là các chất phức tạp, không tan. Laccase có thể tham gia phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quá trình sản xuất khác nhau nhƣ hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ v.v. Laccase đƣợc cố định trên các vật liệu mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator tỏ ra hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất clo phenol khác nhƣ các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (polycyclic aromatic hydrocarbon – PAH), polychlorinated biphenyl (PCB) từ ngành công nghiệp dầu mỏ, thuốc nổ 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) trong ngành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
38
khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu (Dichloro Diphenyl Trichloroethane - DDT, Hexacyclohexan - HCH v.v.), thuốc diệt cỏ hóa học (2,4,5- Trichlorophenoxyacetic acid - 2,4,5-T; 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid - 2,4- D v.v.) dùng trong nông nghiệp [58].
6.8 Lignin peroxidase và Mangan peroxidase
6.8.1 Lignin peroxidase
Lignin peroxidase là một glycoprotein có chứa nhân heme, enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa lignin và các hợp chất có vòng giống lignin khi có mặt H2O2 trong môi trƣờng. LiP có trọng lƣợng phân tử từ 36 – 48 kDa, pH tối thích cho hoạt động trong khoảng 2,5 – 3, điểm đẳng điện pI là 3,2 – 4 [24].
LiP có thể xúc tác các phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol dẫn đến mở vòng do có thế oxy hóa khử cao. Thế oxy hóa khử cao đƣợc giải thích do các hợp chất chất trung gian đƣợc tạo ra trong chu trình xúc tác của LiP là các hợp chất LiPI và LiPII. Chu trình xúc tác của LiP đƣợc miêu tả ở hình 1.11. Đầu tiên LiP bị oxy hóa thành LiPI nhờ H2O2, tiếp theo LiPI oxy hóa cơ chất (hợp chất vòng thơm) và trở thành LiPII. LiPII tiếp tục oxy hóa một phân tử cơ chất khác và trở về dạng ban đầu rồi tiếp tục một chu trình xúc tác khác.
LiP + H2 O2 H2O + LiPI LiPI + R R+.+ LiPII
LiPII + R + 2H+ R+. + H2O + LiP
Hình 1.11. Chu trình hoạt hộng của LiP