2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.7.1Tách DNA tổng số từ nấm sợ
Màng tế bào đƣợc phá bằng lysozym và SDS, DNA tổng số đƣợc giải phóng ra. Việc loại bỏ protein khỏi DNA đƣợc thực hiện bởi enzym proteinaza K. Qui trình các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: Nuôi cấy thu sinh khối nấm
Bƣớc 2: Thu sinh khối bằng cách ly tâm 6000 vòng/10 phút ở 4o
C. Lặp lại vài lần để thu đủ mẫu.
Bƣớc 3: Bổ sung môi trƣờng nuôi cấy để rửa sinh khối, ly tâm 2 lần với 6000 vòng/10 phút ở 4oC.
Bƣớc 4: Dùng panh để lấy sinh khối cho vào cối sứ đã khử trùng và nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52
Bƣớc 5: Dùng thìa xúc mẫu cho vào các ependoff, bổ sung 600µl đệm lyzozym và lắc nhẹ.
Bƣớc 6: Bổ sung tiếp 65µl lysozym, ủ 37o
C trong 30-45 phút. Bƣớc 7: Cho 50µl protenaza K ủ ở 56o
C trong 2 giờ.
Bƣớc 8: Bổ sung tiếp chloroform : isoamyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1)với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích, trộn đều sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào ống Eppendorf mới.
Bƣớc 10: Bổ sung isopropanol với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích, ủ ở 4oC qua đêm. Bƣớc 11: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C, thu tủa. Bƣớc 12: Hòa tan kết tủa trong 500 µl TE.
Bƣớc 13: Loại RNA bằng cách thêm RNAse, ủ ở 37oC qua đêm.
Bƣớc 14: Bổ sung chloroform : isomyalcolhol (tỷ lệ 24 : 1) với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích sau đó đảo nhẹ và ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 15 phút ở 4o
C.
Bƣớc 15: Thu phần dịch nổi phía trên.
Bƣớc 16: Bổ sung ethanol 100% (giữ lạnh) tỷ lệ 1 : 1 về thể tích. Bƣớc 17: Ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C, thu kết tủa sau đó rửa sạch bằng ethanol 80%. Làm khô DNA.
Bƣớc 18: Hòa trong 100µl TE và bảo quản ở 4o
C.