NGUYấN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiờn cứu
2.4 3.1 Cỏc kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm * Kỹ thuật lấy mẫu
* Kỹ thuật lấy mẫu
Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quỏ trỡnh phõn lập và phỏt hiện cỏc vi khuẩn gõy bệnh đường ruột. Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm khụng đỳng cỏch sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoỏn tỏc nhõn gõy bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phõn hoặc chất nụn, thức ăn, chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi, và người tiếp xỳc với bệnh nhõn, mẫu được thu thấp càng sớm càng tốt trước khi điều trị khỏng sinh.
Mẫu bệnh phẩm là phõn phải được lấy càng sớm vỡ vi khuẩn ở trong phõn rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị khỏng sinh, sau khi lấy cho vào lọ khụng cú chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa, nỳt lọ được đậy chặt chống rũ rỉ, cú thể lấy phõn bằng ống thụng trực tràng hoặc tăm bụng vụ trựng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4o
C - 8oC và đưa ngay đến phũng xột nghiệm trong vũng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phũng xột nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bụng vụ trựng sau đú cho vào lọ cú
chứa mụi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phũng xột nghiệm sớm trong điều kiện khụng cần giữ lạnh [4], [20].
Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tớnh đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trớ trờn thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về phũng xột nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập cú tớnh đại diện cho khối nước cần kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trớ mẫu khỏc nhau, trỏnh gõy tạp nhiễm mẫu trong lỳc thu thập, lấy nước vào bỡnh thuỷ tinh vụ trựng 500-1000ml, nếu lấy ở sụng cần chọn nơi nước chảy giữa dũng độ sõu 20-30 cm.
Giỏm sỏt người lành mang trựng trong một vụ dịch tả, tất cả những người tiếp xỳc gần gũi với bệnh nhõn tả đều được coi là cú thể mang mầm bệnh và vỡ vậy cần được theo dừi sức khỏe liờn tục trong vũng 5 ngày kể từ lần tiếp xỳc cuối cựng, để kịp thời phỏt hiện ca bệnh mới. Với những người tiếp xỳc ở đầu vụ dịch cần được lấy phõn xột nghiệm tỡm vi khuẩn tả. Những người tiếp xỳc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phỏt hiện qua xột nghiệm phõn) phải được điều trị dự phũng bằng khỏng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tớnh và giai đoạn hồi phục.
* Bảo quản bệnh phẩm
Cần được giữ vào mụi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phũng xột nghiệm và bệnh phẩm khụng được làm xột nghiệm sau 2 giờ (tớnh từ khi thu thập mẫu). Mụi trường vận chuyển Carry-Blair là mụi trường tốt nhất để bảo quản và vận chuyển, cú thể dựng dung dịch đệm glyxerin, mụi trường vận chuyển đó thu thập mẫu được chuyển sớm tới phũng xột nghiệm hoặc giữ ở tủ lạnh 4oC ( nếu chưa được xột nghiệm ngay ). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kớn để trỏnh lõy lan trong quỏ trỡnh vận chuyển [34].
2.4.3.2. Cỏc phƣơng phỏp chẩn đoỏn V. cholerae
Sơ đồ cỏc phƣơng phỏp chẩn đoỏn V. cholerae trong phũng thớ nghiệm [13].
Hỡnh 2.1. Sơ đồ phõn lập chẩn đoỏn V. cholerae
TCBS, Thạch Kiềm 370 C/ 24 giờ Tính chất sinh hố 370C/3-6 giờ Soi T-ơi Pepton kiềm 370C/3-6 giờ TCBS, Thạch Kiềm Oxidaza (+)
KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); Hơi(-); H2S (-) Mannit (+); di động (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+) Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+) Ng-ng kết kháng
huyết thanh Đa giá O1 Đa giá O139
Đơn giá Ogawa Đơn giá Inaba 370C/3-6 giờ Pepton kiềm Bệnh phẩm
* Kỹ thuật soi tƣơi trực tiếp
Hũa mẫu phõn vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lờn lam kớnh, đậy la men, soi tiờu bản trực tiếp bằng kớnh hiển vi ( Hỡnh 3.4 ) kết quả cho thấy vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường, soi tiờu bản trờn kớnh hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi ngụi.
Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phõn và chất nụn của bệnh nhõn nhằm phỏt hiện vi khuẩn di động. Soi tiờu bản trờn kớnh hiển vi nền đen vi khuẩn tả cú một lụng ở đầu nờn khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngụi. Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu chỳng tụi thực hiện cỏc bước như sau:
- Lam kớnh 1: Hoà mẫu phõn vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lờn lam kớnh, đậy phiến kớnh mỏng (lamen) lờn trờn. Soi tiờu bản trực tiếp trờn kinh hiển vi nếu nghi ngờ V. cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiờn cú một số vi khuẩn đường ruột khỏc cũng di động khi soi tươi trờn kớnh hiển vi).
- Lam kớnh 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phõn lờn lam kớnh, nhỏ một giọt khỏng huyết thanh tả đa giỏ. Phương phỏp soi tiờu bản trực tiếp trờn kớnh hiển vi nền đen đó được sử dụng từ lõu, nhưng khụng được phự hợp với điều kiện của cỏc phũng xột nghiệm tuyến huyện, trờn kớnh hiển vi nền đen phẩy khuẩn tả di động như sao đổi ngụi.
Hỡnh 2.2. Hỡnh vẽ lam kớnh và la men soi tƣơi bằng kớnh hiển vi
Lam kớnh
Phương phỏp soi tươi trờn kớnh hiển vi nền đen hoặc phản pha dựng để phỏt hiện tớnh di động của V. cholerae, đặc biệt khi phõn của bệnh nhõn chứa
>105 vi khuẩn/gam phõn. Hơn nữa kỹ thuật này cũn dựng kết hợp khỏng huyết thanh V. cholerrae để ức chế sự di động trờn nền khi soi và chỉ trong vũng từ
3 - 5 phỳt khoảng 50% vi khuẩn V. cholerae bị tụ lại, vỡ vậy kỹ thuật này cú
giỏ trị để chẩn đoỏn nhanh trong vựng cú dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này tựy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viờn.
* Kỹ thuật nhuộm Gram
Kỹ thuật nhuộm Gram phỏt hiện hỡnh thể và tớnh chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm cú tớm gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cỏch cố định tiờu bản sau đú nhỏ thuốc nhuộm tớm gentian lờn trong 2 phỳt, rửa nước, sau đú nhỏ dung dịch lugol lờn trong 2 phỳt, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o
tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loóng tỷ lệ 1/10 ) lờn trong 1/2 phỳt, rửa nước, để tiờu bản khụ trong khụng khớ hoặc dựng giấy thấm, soi tiờu bản bằng vật kớnh dầu.
Nhận biết vi khuẩn Gram õm bắt màu đỏ, cú hỡnh thể mảnh, cong, hỡnh dấu phẩy, khụng cú vỏ, khụng sinh nha bào, khi nuụi cấy lõu ngày sẽ cú sự thay đổi về hỡnh thể so với ban đầu.
* Phƣơng phỏp dựng kớt nhanh
Dựa trờn nguyờn lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn với khỏng thể đơn dũng đặc hiệu với V. cholerae O1 và O139 thành hai băng
riờng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo vàng) cặp đụi với khỏng thể đơn dũng, cặp đụi này gắn với khỏng nguyờn của mẫu thử. Hỗn hợp khỏng nguyờn - khỏng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose và gắn với khỏng thể khỏng V. cholerae O1 và O139 và hỡnh thành cỏc băng
* Kỹ thuật nuụi cấy
Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua cỏc bước cấy chuyển khỏc nhau do vậy tớnh chất mụi trường nuụi cấy phải cú tớnh chọn lọc ức chế loại vi khuẩn này nhưng lại phự hợp với loại vi khuẩn kia, phương phỏp nuụi cấy được coi là “tiờu chuẩn vàng” tuy nhiờn vẫn cú mặt hạn chế là thời gian trả lời kết quả khảng định lõu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và khụng phỏt hiện được V. cholerae nếu bệnh nhõn đó dựng thuốc khỏng sinh.
* Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction )
Dựng để phỏt hiện gen ctx, kỹ thuật này cú độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn cỏc kỹ thuật khỏc, ngoài ra ỏp dụng kỹ thuật PCR để tỡm độc tố CT trong thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong cụng nghệ sinh học hiện đại và đó đúng gúp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phõn tử, đỏnh dấu một bước tiến vụ cựng quan trọng tương đương với việc khỏm phỏ ra cỏc enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot. Kỹ thuật PCR dựa trờn cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro cỏc
nucleic acid đặc trưng. PCR cho phộp khếch đại theo hàm mũ lờn đến hàng triệu lần cỏc đoạn DNA cú chiều dài từ 200 – 3000 bp. Đoạn DNA được khếch đại ( DNA đớch ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường cú chiều dài khoảng 20 nucleotide. Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được dựng để tổng hợp cỏc đoạn DNA mới trong mụi trường cú 4 loại deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trờn cơ sở khuụn mẫu của một đoạn DNA nhất định đó biết hoặc chưa biết trỡnh tự. Cỏc đoạn DNA mới hỡnh thành lại được sử dụng làm khuụn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA núi trờn được nhõn lờn gấp nhiều lần, nhờ vậy cú thể đủ số lượng để tỏch ra, phõn tớch trỡnh tự hoặc tạo dũng [21], [25].